葛根分子生药学研究进展

　　摘要分子生药学是在分子水平上研究生药的分类与鉴定、栽培与保护及有效成分生产的一门科学，分子生药学的提出让生药的研究从微观向基因水平迈进。葛根作为药食两用植物，具有很高的应用价值和经济价值，品种众多容易造成混乱且根据传统的鉴定方法不易区分鉴别、且葛根在基因水平上的研究尚浅，因此分子生药学对葛根的研究得到学者的广泛关注。该文综述了近年来分子生药学在葛根分子鉴定、转录组测序研究、葛根功能基因的克隆和合成等方面的研究，以期为进一步推动葛根及其有效成分的开发和利用提供参考。

　　关键词葛根;分子生药学;基因;分子标记

　　葛根为豆科葛属植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi(习称野葛)的干燥根，具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒等功效[1]。在现行《中国药典》中收录了2个葛属植物品种：葛根和粉葛，但是在2005年版药典之前未将两者分开，均作为葛根使用。葛根是中国卫生部首批批准的药食两用植物，素有“北参南葛”、“亚洲人参”之美誉，具有很高的应用价值和经济价值。葛根在化学成分、药理药效机制和配伍临床应用等方面的研究已较为深入，随着后基因组时代的来临，分子技术的不断进步，葛根在分子层面上的相关研究逐步被报道。本文综述了近年来分子生药学在葛根分子鉴定、转录组测序、葛根功能基因的克隆和合成研究等方面的研究，以期为进一步推动葛根及其有效成分的开发和利用提供参考。

　　1分子鉴定研究

　　分子鉴定是根据植物的亲缘关系来鉴别，亲缘关系越近，基因遗传相似度越高。葛属植物因其品种多，性状表达多样化，研究者根据传统的性状、显微和简单的理化鉴别不易区分，因此，随着分子技术的发展，已有多种分子鉴定方法被报道在葛属植物中使用。

　　1.1分子标记技术

　　DNA分子标记技术是以生物个体间遗传信息的核苷酸差异为基础的标记技术，是在DNA水平遗传多态性的直接反应，进而揭示生物内在基因的排布规律及其表型性状的表现规律。DNA分子标记的优势在于：不受外界环境、发育阶段的影响;在生物生长发育各个阶段、各个组织均能检测到;标记位点分布广泛，数量众多;④表现为显性或共显性，有利于对隐性基因的选择;⑤许多分子标记技术能提供较为完整的遗传信息，可区分植物个体的纯合子和杂合子基因型[2-4]。分子标记以其独特的优势，并且操作简便，结果准确性高，特异性强等优点，已经被广泛的用于遗传多样性分析、遗传图谱的构建、种质资源鉴定与分类，分子辅助育种[5]等领域。

　　常用的分子标记技术有：RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)、AFLP(扩增限制性内切酶片段长度多态性)、RAPD(随机扩增多态性)、ISSR(简单序列重复区间扩增多态性)、SSR(简单重复序列)、SRAP(相关序列扩增多态性)、SNP(单核苷酸多态性)、SCoT(目标起始密码子多态性)、DNA条形码分析技术等[6-8]。

　　1.1.1RAPD分子标记

　　随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)标记技术是1990年美国学者Williams和Welsh2个研究团队同时发展起来的。RAPD标记的分离情况符合孟德尔遗传规律，可作为一种有效的分子标记技术。因其操作简单、实验成本低、所需DNA量极少、检测效率高等优点，已被广泛用于亲缘关系与种质资源多样性研究、构建DNA指纹和种子纯度的鉴定、构建分子标记连锁图、基因定位和数量性状的选择、分子杂交育种等[9,10]。

　　曾明等[11]为探讨葛属植物间的亲缘关系，利用RAPD技术对葛属6种植物进行分析，以确定它们之间的分类位置，聚类分析表明，葛麻姆P.montana(Lour.)Merr.和粉葛P.thomsoniiBenth不应作为葛P.lobata(Willd.)Ohwi.的变种，应独立成种;峨眉葛P.omeiensisWangetTang不能作为一个独立的种，应归属于葛。唐俊[12]通过RAPD分子标记技术对13份葛属植物进行遗传多样性分析，从72个随机引物中筛选出18个RAPD引物，共扩增出171个标记，多态性标记达80%，聚类分析表明，当遗传距离为0.53时，可将13份葛种质分为5类，且分类之间与地理分布上呈一定的相关性。

　　BettinaHeider等[13]通过RAPD标记分析了5个葛P.lobata(Willd.)Ohwi.和16个三裂叶野葛P.phaseoloides种质的种群间遗传变异，发现大多数变异是在种群之间或无性繁殖下的种质之间发现的，而不是在内部发生的;同时筛选出12个引物对葛进行扩增，共扩增出46个条带，多态性标记占54.3%;聚类表明，将5份材料聚为3类。聚类方式反映了采集的地理位置，并证实了在山谷内的遗传相似系数在0.71~0.87;并筛选出3个引物对16份三裂叶野葛进行扩增，共扩增出11个条带，多态性条带占45.55%，聚类分析表明，当遗传相似系数在0.31时，分为2个类群，它们进一步分为6个亚类，三裂叶野葛的取样地点的地理分布偏离了材料的聚类，与葛的研究结果形成了对比。

　　景戌等[14]利用RAPD分子标记对12份重庆不同来源的葛根种植资源遗传多样性分析，并根据葛根素含量进行聚类分析，12个RAPD引物共扩增出109个条带，多态性条带占64.41%，葛根材料的遗传距离在0.00~0.36之间，平均距离为0.19;RAPD分析的聚类分析表明，当遗传相似系数为0.2时，将12个葛根材料分为3类，依据葛根素含量进行聚类分析表明，当遗传相似系数为2.5时，将12个葛根材料分为3类;两者聚类分析都将12份葛根聚类为3类，但分类情况有所不同，应将两者结合并增大样本量分析才能准确的进行划分。

　　周精华等[15]人通过RAPD分子标记对葛种质资源遗传多样性和亲缘关系分析，筛选出10个引物对8份葛材料进行扩增，共扩增出99个条带，多态性比率为65.65%，遗传相似系数0.626~0.939，聚类分析表明，当遗传系数为0.740时，将8份葛材料分为4类，且聚类分类与地理来源有关。纪宝玉等[16]利用RAPD分子标记技术与葛根素的测定相结合的方法对11个不同产地的葛进行遗传多样性分析，11个地区葛的葛根素为3.26%~7.10%，筛选出8个RAPD引物，共扩增出45个条带，多态性比率为82.22%;聚类分析表明11个不同产地葛被分为3大类，且聚类的亲缘关系与地理分布距离相关，且与葛根素含量相结合的RAPD分析表明不同地区葛根药材中葛根素含量与样品间的遗传相似性无显著关系。

　　魏文恺[17]采用RAPD标记对山西6个主要产地的葛资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，将6个不同产地的晋产葛分为3类。有研究表明，RAPD标记的可靠性低于RFLP，SSR，AFLP3种分子标记，并且RAPD为显性标记，在遗传多样性分析中很容易将非同源的扩增片段误认为同一位点，因此而产生数据统计错误[18]。RAPD反应容易受到外界因素影响，重复性和稳定性较差，限制了其进一步的发展。

　　1.1.2SSR分子标记

　　简单重复序列(SSR)，也被称为微卫星DNA[19]，是由1~6个单核苷酸为重复单元串联的重复序列。因其操作简单方便、通用性强、分辨率高、重复性好且仅需少量DNA样品，已被广泛应用于遗传多样性分析、种质鉴定、构建遗传连锁图谱、基因定位与克隆、数量性状基因位点分析、构建DNA指纹图谱等研究。周荣荣等[20]人利用SSR分子标记对江西不同种质的粉葛进行遗传多样性分析，用生物信息学的方法去寻找葛和甘葛藤基因组SSR序列，并寻找其差异基因，根据其差异基因设计了20对SSR引物，筛选出5对多态性强、扩增带型稳定、重复性较好的引物对江西9个粉葛品种进行遗传多样性分析，共检测到32个等位基因，16个多态性位点。

　　聚类分析表明，遗传相似系数变异范围为0.5433~1.000，平均遗传相似系数为0.7359，将9个江西粉葛分为3大支，5对核心引物可将其准确区分为6类粉葛种质，说明可能存在“同物异名”或亲缘关系非常接近的情况。微卫星的分辨能力比以前可用的标记更高，可以检测源自特定亲本的等位基因的种群行为[21]。但是SSR标记的分析可能会带来假阳性结果，导致DNA复制过程中聚合酶滑移、空等位基因或重叠的SSR，并且开发和合成引物投入高、难度大、相对费时[22]。高昂的成本价格和开发的困难是制约SSR分子标记发展的主要原因。

　　1.2DNA条形码

　　DNA条形码技术是分子鉴定的最新发展方向，它是利用一段短而标准的DNA序列作为标记来实现快速、准确和自动化物种鉴定的方法。2003年由加拿大科学家Herbert提出DNA条形码的概念[38]，2015年正式被收录进《中国药典》并构建中药材DNA条形码数据库。适用于植物的条形码主要包括psbA-trmH，rbcL，rpoC1，rpoB，matK，ITS，ITS2等。

　　DNA条形码技术不受生长发育阶段、生态环境及个体形态的限制，样本用量少，鉴定结果准确、可重复性好且对操作人员要求不高，可以准确地对中药进行分析鉴定。曾明等[39]人利用DNA条形码技术对葛属植物葛、粉葛和葛麻姆等进行亲缘关系分析，表明粉葛应作为葛的变种，葛麻姆应独立成种，且ITS序列分析的结果与从化学成分分类的结果相吻合，但分析结果与使用RAPD分子标记技术分析的结果不同，RAPD标记结果支持山葛和粉葛不应作为葛的变种，应独立成种[11]。

　　RAPD分子标记因其技术本身的局限性，导致结果不完全可靠，ITS序列分析结果更准确，是鉴定葛属植物的有效分子标记技术。为了从基因层面上为葛根进行选育优良品种，余智奎[40]利用DNA条形码技术对葛根种质资源的基因型进行研究并结合药效成分进行评价，结果表明，葛根ITS序列变异较大，基因型较多，共分为13个基因型;利用药效成分含量进行评价，发现基因型不同是导致葛根中葛根素含量差异的原因之一，但是不同基因型总黄酮含量无明显变化;叶绿体基因trnL内含子序列无变异，仅一个基因型，叶绿体基因psbK-psbI和trnH-psbA序列变异结果都将24个样品分为2个基因型，且碱基位点变异与产地相关。每个物种DNA中G+C的含量是特定的，能够反映属种之间的亲缘关系。

　　蒋向辉等[41]人基于ITS序列对11份葛属种质资源进行亲缘关系研究，结果表明，11份葛属种质的ITS序列G+C含量差异大，G+C含量在52.98%~59.89%之间，最大相差6.91个百分点;遗传距离为0.002~0.792;同时采用MP，NJ和UPGMA3种不同系统发育树构建方法进行分析，均将11份种质分为2大支，但各自分析结果有所不同，应该综合3种聚类方法获得更可靠的结果。同时蒋向辉等[42]人通过形态学和rDNAITS序列方法对葛属植物分类进行一致性比较，两种方法的分类结果虽有一定的相似性，但仍存在较大的差异。形态学特征容易受到生长条件、性状选取等多方面因素影响，因此，基于ITS序列的分类结果更为可靠。

　　2葛根转录组测序技术研究进展

　　转录组是后基因组时代最活跃的学科之一，转录组测序技术是研究葛根转录组学的重要手段，第2代高通量测序技术是当前转录组测序中最主要的分析技术。

　　Han等[48]人利用转录组测序技术，从葛根5种不同组织中获得了9300万个fastq格式读数，随后通过CLC从头组装方法，最终总共产生了83401个重叠群，有26245个重叠群产生了相应的GO术语，获得了对应于16380个重叠群的1348个独特的酶，并随后使用KEGG检索到了途径;根据功能注释结果，预测了45个重叠群，它们代表了大豆苷元生物合成的7个关键酶;通过检索注释数据，检索到了41个表达的ABC转运蛋白;在数据集中有49个重叠群被标注为葡萄糖基转移酶。

　　Wang等[49]人利用转录组测序技术对葛进行转录组分析，获得了13.3G的有效数据，并从头组装出163625个单基因，其中70593个单基因(占组装单基因的43.1%)在Nr蛋白数据库中被成功注释，有22684个单基因被归类为25个KOG类别，有46467个单基因被分配给GO术语，有23949个单基因在KEGG数据库中被注释，并分配到308条不同的途径;在葛转录数据库中，鉴定出54个异黄酮生物合成相关的结构基因序列，预测了117个单基因编码PIUGTs，确定了51个编码异黄酮O-甲基转移酶的假定单基因，并且有327个单基因被鉴定为假定的MYB转录因子。

　　Nithiwat等[50]人利用高通量测序技术，对泰国葛根(Puerariacandolleivar.mirifica)的幼叶、成熟叶、块茎皮层和去皮块茎的联合组织进行转录组分析，总共产生了约8.2G的碱基对，重新组装产生了166923个重叠群和104283个单基因;166923个重叠群，用于使用蛋白质数据库进行功能注释，并作为识别可能参与异黄酮和葛雌激素生物合成的基因库;在转录库中，鉴定了21个可能参与异黄酮生物合成的基因，鉴定了85个可能编码MYB转录因子的基因;经qRT-PCR验证，这些单基因的DEG值在块茎皮质的表达水平高于其他三种组织。

　　3葛根功能基因的克隆及合成途径研究

　　传统中药材的有效成分绝大多数是次生代谢产物，其合成途径复杂，反应过程往往需要十几个甚至几十个酶的催化，因此，找到形成特定产物的关键酶就成为对药材进行合成的分子机理与调控研究的关键步骤，从而进一步利用基因工程技术生产药用植物的有效成分。葛根中含有异黄酮类、葛酚苷、香豆素类、三萜类、淀粉、多糖等成分[54]。葛根的药用成分主要是异黄酮类化合物，其主要有效成分包括葛根素、大豆苷和大豆苷元等次生代谢物，具有保护心脑血管系统、降血糖和血脂、抗肿瘤、抗氧化、解酒等生物活性[55]，分别按照相应生物合成途径而产生。

　　4展望

　　分子生药学是指在分子水平上研究生药的分类与鉴定、栽培与保护及有效成分生产的一门科学[69]。分子生药学是生药学和分子生物学两学学科交叉融合的产物，1995年由黄璐琦等[70]首次提出，分子生药学的提出让生药的研究从宏观表型性状和微观的显微、化学成分等研究向基因水平迈进，强化了对生药细胞、组织、器官、有机体、种群等层次的重新认识和思考。

　　随着生物技术手段的飞快发展，分子生药学已经在生药分子鉴定、药用动植物的系统进化和种质资源评价及保存、药用动植物濒危机制及保护、药用植物活性成分的生物合成及调控、药用动植物的道地性及分子机理等方面已有了广泛的应用[71]。DNA分子鉴定技术具有特异性强、灵敏度高等明显优势，可作为葛属植物的生药鉴定手段，实现葛属植物品种鉴定，区分葛根及其混伪品。

　　一些新型的分子标记技术例如SCoT分子标记技术、SRAP分子标记技术和DNA条形码技术等，对葛属植物的分类、混伪品及亚种之间的鉴定结果更为准确，但在葛属植物中运用较少，应结合这些分子鉴定方法使鉴定更为准确。利用分子生药学技术对葛根有效成分的生物合成及相关基因的研究尚处于起步阶段，虽然已有学者对部分葛根有效成分合成相关基因进行了克隆和分析，但大部分调控代谢产物合成的基因还未有研究报道。

　　中药论文投稿期刊：《中国现代中药》原名《中药研究与信息》，1999年3月创刊，是国家中医药管理局主管，中国中药协会、中国医药集团总公司、中国药材公司主办的国内外公开发行的中药行业综合性科技期刊，月刊，2006年更名为《中国现代中药》。

　　在今后的研究中，可充分利用多组学技术联合分析，充分挖掘次生代谢产物生物合成的相关基因、基因酶、转录因子、调控蛋白以及次生代谢途径等，建立次生代谢产物生物合成的相关模型，从而更好的理解葛根有效生物合成的相关分子机制。随着后基因组时代的到来，对葛根基因组学大数据更容易获得，从而从分子机制和基因组学的研究上解决葛属植物在分类中的疑惑以及将野葛和粉葛临床用药实现本质区分，葛根分子生药学研究具有广阔的发展前景。

　　参考文献

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　　[4]吴晓雯，王铁杆，刘颖，等.DNA分子标记技术在坛紫菜(Pyropiahaitanensis)中的应用[J].渔业研究，2020，42(3)：281.

　　[5]吴问广，董林林，陈士林.药用植物分子育种研究方向探讨[J].中国中药杂志，2020，45(11)：2714.

　　[6]ADHIKARIS,SAHAS,BISWASA,etal.Applicationofmolecularmarkersinplantgenomeanalysis:areview[J].TheNucleus,2017,60(3):283.

　　[7]陈士林，吴问广，王彩霞，等.药用植物分子遗传学研究[J].中国中药杂志，2019，44(12)：2421.

　　作者：杨碧穗1，黄秋连1，谢璐欣1，吴波1，邓可众1，吴志瑰1，朱卫丰1，何绍浪2，黄琦3，朱玉野4，葛菲