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摘要为了解小眼畸形相关转录因子mitf基因在鱼类早期体色褪黑过程中的调控作用,本研究采用RACE技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophuscitrinellus)mitf基因cDNA序列全长,利用qRT-PCR技术检测其在橘色双冠丽鱼胚胎不同发育时期、体色褪黑不同时期和各个组织中的表达规律。获得mitf基因2个亚型,其中,mitf1的cDNA全长为1816bp,包括5′非编码区(UTR)158bp、3′UTR428bp、开放阅读框(ORF)1230bp,共编码409个氨基酸;mitf2的cDNA全长为1638bp,5´UTR长160bp,3´UTR长428bp,ORF长1050bp,共编码349个氨基酸。同源性和系统进化分析显示,mitf1和mitf2聚在一小支,与慈鲷科(Cichlidae)鱼类同源性最高,与哺乳类动物同源性较低。qRT-PCR结果显示,在成鱼各个组织中mitf1和mitf2均有不同程度表达,其中,眼部表达量最高且显著高于其他组织(P<0.05),肌肉、脑和肾脏也有较高表达;mitf1和mitf2在胚胎各个发育时期均有表达,在受精卵时期表达量最高,显著高于其他胚胎期;随着橘色双冠丽鱼体色由黑色过渡到橘黄色,mitf1和mitf2在鱼皮肤、鳞片、尾鳍中的表达均呈逐渐下降趋势,表明mitf基因表达与鱼体色由黑到黄转变的表型间存在关联性,推测与鱼体色发育阶段色素细胞的分化和分布比例的动态变化相关。本研究通过了解鱼类体色发育和变异的分子基础,可为鱼类色素细胞发育和体色人工改良积累资料。
关键词橘色双冠丽鱼;小眼畸形相关转录因子(MITF);qRT-PCR;黑色素细胞
MITF(Microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)即小眼畸形相关转录因子,由Hertwig(1942)于放射诱导的突变小鼠中发现,突变体的后代会出现小眼畸形、早发性耳聋、皮毛和虹膜色素减退等症状。MITF是动物皮肤、眼睛和羽毛色素中黑色素细胞发育的关键调控因子(Linetal,2019),具有基本–螺旋–环–亮氨酸拉链(Basichelix-loop-helix-leucinezipper,bHLHZip)结构,以二聚体的形式与络氨酸家族启动子Mbox高度结合,通过直接调控dct、tyr、tyrp1、c-kit和bcl2等基因的表达,从而在黑色素细胞的发育、存活、迁移、增殖和分化过程中发挥重要作用(Steingrimssonetal,2004)。在哺乳动物中,mitf基因的突变或缺失可能会导致动物耳朵、眼睛、毛发、体色等表型发生改变,如鹌鹑(Coturnix)白色羽毛的产生(Minvielleetal,2010);马(Equuscaballus)(Hauswirthetal,2019)和犬(Canislupusfamiliaris)(Korbergetal,2014)皮毛白色斑点的出现等。
在鱼类中,mitf作为治疗黑色素瘤潜在的靶基因,已在斑马鱼(Daniorerio)中开展了大量研究(Listeretal,2014),在东方鲀(Lietal,2013)、锦鲤(Cyprinuscarpio)(Liuetal,2015)、鲫鱼(Carassiusauratus,redvar.)(Zhangetal,2017)等鱼类中也开展了mitfa在胚胎和各个成鱼组织中表达情况的研究,初步探索了mitfa在鱼类体色形成过程中的作用,但其具体的调控机制及与其他体色相关基因的联级作用仍未被阐明。橘色双冠丽鱼(Amphilophuscitrinellus),俗称红魔鬼,原产于中南美洲的尼加拉瓜、哥斯达黎加等地,是一种既可食用又可观赏的大型热带鱼类(Barluengaetal,2010;Kauttetal,2012)。通常1龄可达性成熟,成熟后的丽鱼体色为橘红色或橘色,生产上常将其作为父本与红头丽鱼(Cichlasomasynspilum)杂交,产生更具观赏性的子一代血鹦鹉鱼(♂A.citrinellus×♀C.synspilum)。
橘色双冠丽鱼在发育过程中会出现体色过渡的现象,体色由最初黑色过渡至灰色,灰色再过渡至亮黄色,这一现象称为体色褪黑(蒋燕玲,2016),主要是由于色素细胞的形成、增殖、迁移和分化所致。橘色双冠丽鱼含4种色素细胞,包括黑色素细胞、黄色素细胞、红色素细胞和虹彩细胞,其中,红色素细胞和虹彩细胞只在特定部位分布且数量较少,黑色素细胞和黄色素细胞在“黑色–灰色–黄色”3个时期均有分布,孵化后至体色由黑到黄的转变过程中,黑色素细胞数量呈逐渐增加而后又减少的趋势,黄色素细胞数量则呈一直增加趋势(韦敏侠等,2015)。
目前,国内外对鱼类早期体色褪黑这一复杂生物学过程的研究相对较少,其调控机制仍不明确。鱼类体色的形成和分布主要是由其体表鳞片和皮肤中色素细胞的类型、分布和数量所决定(Shietal, 2015;Yuetal,2012),目前,已在鱼类中鉴定出6种色素细胞,包括黑色素细胞、黄色素细胞、红色素细胞、虹彩细胞、白色素细胞和蓝色素细胞(Volkeningetal,2018)。其中,黑色素细胞分布最为广泛,含有大量的黑色素颗粒,能够吸收特定波长的入射光,使鱼的颜色呈现黑色/灰色(Zhangetal,2017)。
黑色素细胞起源于外胚层神经嵴细胞,由神经嵴细胞经黑素母细胞、黑素干细胞发育至成黑色素细胞(Cohenetal,2016),黑色素细胞的形成受一系列通路和基因的严格调控(Houetal,2008),其中,MC1R/α-MSH信号通路(Newtonetal,2007)、PI3K/Akt信号通路(Khaledetal,2002)、MAPK信号通路(Wangetal,2017)、WNT/β-catenin信号通路(Yamadaetal,2010)、NO信号通路(Parketal,2009)为最常见的5条信号通路,mitf作为这5条通路共有的靶向基因,直接关联黑色素细胞发育所必需的多个基因的表达,包括dct、tyr、c-kit和bcl2等,对黑色素细胞存活、迁移、增殖和分化起着关键性作用(Steingrimssonetal,2004)。本研究拟聚焦黑色素合成关键基因mitf,检测其在橘色双冠丽鱼各组织、胚胎发育各时期和体色褪黑转换期的表达模式,了解其在鱼类体色褪黑调控中的作用规律。
1材料与方法
1.1实验材料
橘色双冠丽鱼取自中国水产科学研究院珠江水产研究所。选取性成熟且体色为橘色的健康双亲进行配对,获取不同发育时期的胚胎,包括受精卵、卵裂期、原肠期、神经期、视泡期、听泡期、心脏形成期、血液循环期等8个时期胚胎(蒋燕玲,2016)。在体色发育的3个褪色阶段“黑色、灰白、黄色”各取3尾鱼,剥离鳞片、皮肤和尾鳍。同样选取性成熟且体色为淡黄色的橘色双冠丽鱼3尾,分离鳃、脑、肌肉、性腺、眼、肾、心脏等7个组织。所取材料均用Trizol保存,置于–80℃冰箱保存,用于RNA提取和荧光定量分析。
1.2实验方法
1.2.1mitf基因
cDNA全长克隆取性成熟橘色双冠丽鱼皮肤、鳞片、尾鳍于Trizol中,按TissueRNAKit(OMEGA)试剂盒操作步骤提取总RNA,通过1%琼脂糖凝胶电泳和SynergyTMNEOHTS多功能酶标仪检测RNA的完整性、纯度及浓度。利用Prime ScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa)反转录试剂盒合成cDNA第一链,置于–20℃冰箱保存。根据已知慈鲷科(Cichlidae)鱼类保守序列,利用Primer5.0软件设计扩增引物mitf-F和mitf-R,以cDNA第一链为模板,扩增目的基因片段。
25μL扩增体系:16.75μLddH2O,4μLdNTPMIXS,2.5μL10×Buffer,0.5μL模板,上下游引物各0.5μL,0.25μLrTaq酶;反应条件:94℃预变性3min,94℃变性30s,55℃退火60s,72℃延伸60s,35个循环,72℃后延伸5min。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后,扩增产物送广州艾基生物有限公司进行测序。
根据测序结果设计mitf5′race和3′race巢氏引物,通过SmarterRace5′/3′KitComponents(TaKaRa)试剂盒进行5′末端和3′末端序列扩增。扩增后PCR产物进行胶回收、连菌、37℃培养过夜,挑选阳性克隆进行测序。利用软件VectorNTI将mitf5′端、3′端及其中间序列拼接,从而获得橘色双冠丽鱼完整mitfcDNA序列。
2结果
2.1橘色双冠丽鱼
mitf基因cDNA全长和氨基酸序列分析获得橘色双冠丽鱼mitf基因2个亚型mitf1和mitf2,其中,mitf1cDNA全长为1816bp,5′UTR长158bp,3′UTR长428bp,开放阅读框(ORF)为1230bp,共编码409个氨基酸。预测其蛋白质分子量为39.1kDa,理论等电点为5.23,亲水性系数为–0.603。TMHMM2.0查找发现无跨膜结构。磷酸化位点分析显示,该蛋白包含27个丝氨酸(S)磷酸化位点、9个苏氨酸(T)磷酸化位点、5个络氨酸(Y)磷酸化位点。使用SOPAMA预测蛋白二级结构,其中,α螺旋结构131个(占37.01%),β折叠22个(占6.21%),无规则卷曲结构177个(占50%),延展链结构24个(占6.78%)。
mitf2的cDNA全长为1638bp,5′UTR长160bp,3´UTR长428bp,ORF为1050bp,共编码349个氨基酸。预测其蛋白质分子量为38.5kDa,理论等电点为5.23,亲水系数为–0.645。mitf1和mitf2氨基酸序列比对结果显示,mitf1亚型氨基酸序列与mitf2亚型相比,在0~53的位置多53个氨基酸,82~86的位置多5个氨基酸,其余位置完全相同。TMHMM2.0查找发现无跨膜结构。
磷酸化位点分析显示,该蛋白包含27丝氨酸(S)磷酸化位点、9个苏氨酸(T)磷酸化位点、5个络氨酸(Y)磷酸化位点。使用SOPAMA预测蛋白二级结构,其中,α螺旋结构142个(占40.69%),β折叠14个(占4.01%),无规则卷曲结构174个(占49.86%),延展链结构19个(占5.44%)。与mitf1蛋白二级结构相比,除在0~53和82~86位置多出氨基酸及个别位点结构不同外,二级结构基本一致。
2.2mitf基因同源比对和系统进化树分析
橘色双冠丽鱼2个亚型mitf1和mitf2的bHLHzip结构氨基酸序列与大多数物种高度一致,表明bHLHzip结构在进化过程中较为保守。利用MegAlign软件分析橘色双冠丽鱼mitf基因氨基酸序列与其他物种的同源性,结果显示,橘色双冠丽鱼mitf1氨基酸序列与斑马拟丽鱼(Maylandiazebra)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)和萨伊蓝六间(Cyphotilapiafrontosa)等鱼类同源性最高,分别为90.7%、91.9%和93%,与其他硬骨鱼类如大黄鱼(Larimichthyscrocea)、斑鱼(Channaargus)和孔雀鱼(Poeciliareticulata)也有较高的同源性,分别达到了85.6%、87.4%和82.1%,而与人(Homosapiens)、黑猩猩(Pantroglodytes)、鸡(Gallusgallus)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)则相对较低,只有60%、60.9%、58.9%和63.1%。
3讨论
3.1mitf基因的cDNA全长和氨基酸序列分析
通过Race技术获得橘色双冠丽鱼mitf基因cDNA全长,2个亚型MITF1和MITF2均具有3个结构域:靠近N末端的MITF_TFEB_C_3_N结构域、bHLHZip结构域和一个未知功能结构域(DUF3371)。bHLHZip结构域作为MITF蛋白的功能区域,在进化过程中高度保守,其中,HLHZip区域能够与自身或色素细胞的形成、增殖、迁移和分化起着重要的调控作用,而mitfb不参与黑色素细胞的发育,只在眼色素上皮细胞中表达,参与眼调控的发育(Listeretal,2014)。
本研究克隆的mitf1和mitf2为mitf基因2个亚型,均属于mitfa亚型,理化性质分析结果显示,mitf1和mitf2的蛋白质二级结构极为相似,荧光定量结果显示,mitf1和mitf2除了在胚胎期表达量有差异外,在各个组织和各转换时期表达量变化趋势基本一致,因此,推测mitf1和mitf2更多地保留了mitfa基因功能,未出现明显基因功能分化。同源比对发现,橘色双冠丽鱼mitf1、mitf2与尼加拉瓜湖始丽鱼、萨伊蓝六间、斑鱼等鱼类具有较高的同源性,与哺乳类、鸟类、爬行类等同源性较低,符合橘色双冠丽鱼传统进化地位。
3.2mitf基因表达差异分析
3.2.1mitf基因在胚胎发育时期的表达
mitf1和mitf2在橘色双冠丽鱼8个胚胎发育时期均有表达,其中,在受精卵时期表达量最高,显著高于其他发育期(P<0.05),表现出明显的时期特异性。研究发现,mitf基因也在其他动物胚胎发育期开始表达,但表达的时期较晚,如非洲爪蟾胚胎在21/22期开始表达(Kumasakaetal,2010),鸡(Mochiietal,1998)和鼠(Musmusculus)(Nakayamaetal,1998)胚胎则在5日龄和9.5日龄开始表达。
生物学论文投稿刊物:《基因组学与应用生物学》主要刊登现代生物技术的前沿学科和基础学科如基因组学、分子细胞遗传学、生化与分子生物学、基础医学和应用生物学等相关的原始研究成果。刊登人类、动物、微生物及植物领域在组织、器官、细胞、染色体、蛋白质、基因、酶和发酵工程等不同水平上的现代生物技术等基础与应用基础研究成果。
在青鳉鱼中,mitf基因在胚胎整个发育过程中最早表达于2细胞期,这与橘色双冠丽鱼表达模式相类似(Lietal,2013)。蒋燕玲等(2016)对橘色双冠丽鱼胚胎组织学观察发现,黑色素细胞在血液循环期才开始出现,而mitf在受精卵时期即出现高表达现象,结合前人报道,推测鱼类发育早期mitf不仅调节黑色素细胞分化和发育,对视网膜色素上皮细胞、破骨细胞和肥大细胞中也有不同程度的调控作用(Baueretal,2009)。在卵裂期,mitf1、mitf2基因表达量骤减,mitf1随胚胎发育表达量继续降低直至听泡期骤升后又继续下降,而mitf2随胚胎发育表达量逐渐升高直至血液循环期,仍呈现上升趋势,预示mitf基因可能在黑色素细胞的发育过程中扮演着十分重要的角色。
参考文献
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作者:陈旭东1,2邬国强1,2宋红梅2①汪学杰2牟希东2刘奕2刘超2胡隐昌2