江苏植物细胞遗传学研究回顾与展望

　　摘要:20世纪初“遗传的染色体学说”的提出和证明标志着细胞遗传学交叉学科建立，伴随相关学科的发展，20世纪60年代末期细胞遗传学又与分子遗传学相结合，建立发展了分子细胞遗传学交叉学科。分子细胞遗传学以DNA分子原位杂交技术为核心，不断拓展应用领域，为生命科学研究提供了直观、高效的技术手段。原位杂交技术与基因组、细胞生物学等技术结合，被广泛应用于人类、动物、植物的起源、进化、驯化等基础研究和远缘杂交、染色体工程等应用研究。通过形象地展示DNA、RNA、蛋白质在细胞中的实际位置，揭示DNA序列之间的实际位置和顺序、亲缘物种间的进化关系和结构重排、基因组拼接序列的质量、转录水平RNA和翻译水平蛋白质的位置和数量变化等。江苏省遗传学会会员单位南京农业大学、扬州大学、南京林业大学、江苏师范大学、徐淮地区农科院等自20世纪中期开展细胞遗传学理论技术研究，伴随学科发展不断创新，建立了较完善的分子细胞遗传技术体系，并成功应用于开展植物系统进化、远缘杂交、染色体工程、基因组学等研究，取得了一批研究成果。本文将主要综述江苏省在该领域取得的重要进展，并展望未来发展方向。

　　关键词:江苏省遗传学会;分子细胞遗传学;DNA分子原位杂交;染色体工程;基因组学

　　20世纪初期，美国遗传学家Sutton和德国生物学家Boveri提出“遗传的染色体学说”，该学说的证明标志着细胞遗传学的诞生和成熟。以美国康奈尔大学为核心的科学家利用玉米作为研究对象，阐明了植物性状遗传变异的细胞学基础，建立和完善了植物细胞遗传的理论和技术体系。日本的Kihara教授和美国的Sears教授以异源六倍体小麦(TriticumaesticumL.)及其祖先种为研究对象，建立了麦类植物细胞遗传学技术，并将其应用于异源多倍体小麦的基因组分析、非整倍体创制和鉴定、小麦远缘杂交等研究，阐明了小麦3个亚基因组的起源、麦类植物不同亚基因组染色体间的部分同源关系。此后，研究者们在很多植物物种中开展了细胞遗传研究，建立了染色体核型分析、染色体构型分析和染色体分带等经典细胞遗传学核心技术，为物种的起源、系统分类、以及植物遗传改良等提供了基础的细胞学信息。

　　伴随遗传物质的发现、DNA双螺旋结构解析、探针标记技术和显微技术等不断取得突破，分子遗传学理论和技术快速发展，并向细胞遗传学不断渗透，20世纪60年代末期美国耶鲁大学Gall等科学家在动物中建立的DNA分子原位杂交(insituhybridization,ISH)技术，成为分子细胞遗传学这一分支学科建立的里程碑。该技术很快被用于植物细胞遗传学研究，并得到快速发展和广泛应用，为植物遗传育种、基因组学和分子生物学研究提供了直观有效的研究手段。ISH伴随相关学科的发展不断发展，杂交利用的探针分子可以是DNA、RNA和蛋白抗体;DNA探针包括基因组DNA、重复序列DNA、BAC等人工染色体克隆、单拷贝基因DNA、寡核苷酸探针库等。

　　探针标记物包括放射性分子、半抗原、荧光素等;杂交的对象包括有丝分裂中期染色体、减数分裂粗线期或中期I染色体、间期核DNA纤维。由此建立了genomicinsituhybridization(GISH)、multi-colorfluorescenceinsituhybridization(FISH)、BAC-FISH、fibre-FISH、oligo-FISH、oligo-painting、immuno-staining、seqFISH、rmFISH等新技术，通过形象地展示DNA、RNA、蛋白质在细胞中的实际位置，揭示DNA序列之间的实际位置和顺序、亲缘物种间的进化关系和结构重排、基因组拼接序列的质量、转录水平RNA和翻译水平蛋白质的位置和数量变化等。

　　江苏省植物细胞遗传学研究起步较早，覆盖面广，应用成效显著。围绕水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticumaestivum、棉花(Gossypzumhirsutum)等主要作物以及瓜属(Cucumis)、甘薯(Ipomoeabatatas)、菊属(Chrysanthemum)、杨属(Populus)园艺和林木植物，建立了完善的细胞学和分子细胞遗传学研究体系，成功应用于遗传改良、基因组解析和比较基因组、物种起源进化、染色体生物学等研究领域，取得了多项基础和应用研究成果。在江苏遗传40周年之际，本文将回顾江苏省遗传学会会员单位围绕主要粮食作物、园艺作物、林木等物种，在植物分子细胞遗传学领域的重要研究进展，并展望该研究领域未来的发展方向。

　　1普通小麦(2n=6x=42，基因组AABBDD)是异源六倍体。小麦及其近缘物种染色体大，容易观察其形态结构，因此成为早期植物细胞遗传学研究的优良材料。Kihara教授建立基于远缘杂交和细胞遗传学技术的染色体组分析理论，阐明了栽培小麦A、B和D3个亚基因组以及其他小麦族物种的二倍体、四倍体祖先供体。Sears教授是小麦细胞遗传学和染色体工程的先驱，20世纪30年代开始历时40余年，先后培育出小麦单体、三体和缺体-四体及端体等非整倍体系列，将小麦3个染色体组的染色体根据其补偿关系划归到7个部分同源群。

　　Gill教授实验室建立了可识别全部21对小麦染色体的分带技术(1991)[1];Rayburn和Gill[2~4]最早利用生物素标记的重复序列探针进行ISH，识别小麦染色体;Mukai等[5]建立基于重复序列的双色ISH技术，可识别17对小麦染色体;Zhang等[6]建立以乌拉尔图小麦A组和粗山羊草D组为探针、拟斯卑尔脱山羊草S组为封阻的GISH技术，可以区分普通小麦A、B、D3个亚基因组。

　　近年来，基因组测序技术的快速发展不仅为分子生物学研究提供了丰富的信息，同时也加快了植物分子细胞遗传学的研究，尤其是用于小麦FISH的探针不断发展，出现了寡核苷酸FISH、单拷贝基因FISH和基于单拷贝基因的寡核苷酸探针库。此外，在小麦中还建立了基于流式细胞仪的染色体分拣、基于显微切割的特定染色体区段切割分离等分子细胞遗传学技术，用于结构和功能基因组研究[7~10]。建立的黑麦、大麦等的分子细胞遗传学技术体系，为小麦与近缘物种的远缘杂交、染色体工程和比较基因组研究提供了有效的技术手段。下面简要介绍南京农业大学在小麦分子细胞遗传学领域的研究进展。

　　1.1小麦及近缘物种染色体鉴定技术

　　染色体身份和染色体结构的准确快速鉴定是开展染色体工程、基因组分析等研究的重要基础。早在20世纪80年代初期，江苏省遗传学会学会前理事长、南京农业大学细胞遗传研究所刘大钧院士带领团队，与Gill教授合作，开展小麦及其近缘物种染色体鉴定技术研究。先后在六倍体普通小麦、四倍体硬粒小麦、簇毛麦、大赖草、鹅观草属等物种中建立了染色体分带技术[11~18];染色体分带与染色体配对的构型分析结合，纠正了小麦4A和4B的身份[11]，初步分析我国特有半野生小麦的染色体组成，用于鉴定创制的硬粒小麦-簇毛麦双二倍体等远缘种质[19,20]。20世纪90年代开始分子遗传学研究。

　　建立了以生物素标记基因组DNA为探针的体细胞和花粉母细胞染色体GISH技术，明确了小麦-簇毛麦易位系中小麦和外源染色体的组成[21];从外源物种中克隆基因组特异重复序列,利用在簇毛麦中克隆的特异重复序列进行ISH，特异识别小麦背景中的簇毛麦染色体[22];建立了基于荧光素标记探针的GISH技术，用于鉴定导入小麦背景中的鹅观草属、赖草属、黑麦、偃麦草等物种的染色体或染色体区段[23~30]，实验室研究全面进入分子细胞遗传学阶段。重复序列探针的开发和荧光素标记技术的发展，为基于重复序列和双色/多色FISH的核型分析提供了更快速精确的技术手段。

　　Zhang等[6]利用pSc119.2等4个质粒探针构建了簇毛麦品系91C43的FISH核型，并用于鉴定小麦-簇毛麦异附加系、代换系和易位系中外源染色体的具体身份;为提高FISH效率，Du等[31]开发了基于重复序列的寡核苷酸探针库，并用于鉴定小麦品种、黑麦、偃麦草等染色体结构变异;王艳芝[32]开发了一批寡核苷酸探针用于替代原先的质粒探针，通过ND-FISH或FISH鉴定小麦染色体组成;进一步优化小麦、百萨偃麦草、黑麦等寡核苷酸探针套，建立栽培一粒小麦、硬粒小麦、荆州黑麦、长穗偃麦草等物种的标准核型，可快速鉴定小麦背景中的外源染色体，并构建建国以来我国373个大面积栽培品种及骨干亲本高清核型，揭示其中存在的自发结构变异[31,33~35]。Guo等[36]利用寡核苷酸探针FISH分析了异花授粉黑麦品种染色体演化特征，并细胞学定位荆州黑麦毛颈基因区段。

　　Sun等[37]利用基于簇毛麦基因组序列新开发的寡核苷酸探针，结合利用4个已报道寡核苷酸探针，构建了簇毛麦不同品系的FISH核型，揭示了不同品系间的核型多态性。为解析外源染色体基因组序列，开发更多近缘物种特异重复序列探针和特异分子标记，克隆外源优异基因，与捷克Dolezel教授实验室合作，利用流式细胞仪分拣了簇毛麦6VS和4VS染色体，Xiao等[38]在解析4VS序列基础上，通过生物信息学鉴定出两条反转录转座子重复序列，经FISH分析发现均特异弥散分布于簇毛麦所有染色体上，杂交信号与GISH信号相似;Lei等[39]利用6VS染色体分拣测序获得的基因组序列信息，开发了基于重复序列的7个寡聚核苷酸探针，将其中两个探针相结合，进一步丰富了簇毛麦的FISH核型。

　　2水稻(2n=2x=24)是重要的粮食作物，基因组大小389Mb[67]，是禾本科作物中基因组最小的作物。水稻是最早完成基因组测序的作物，因此也成为作物学研究的模式物种。基因组大小与细胞核内的染色体大小一般呈正相关的关系，水稻染色体在禾本科作物中也属于最小的类型之一，因此水稻细胞遗传学相较于玉米、小麦起步较晚。

　　2.1水稻染色体鉴定技术由于水稻有丝分裂前中期染色体很小，不同染色体的大小十分接近，因此仅仅依靠形态特征很难完全准确辨别出水稻体细胞中的所有染色体。因此，在20世纪90年代以前，有关水稻核型中的染色体相对长度、臂比、核仁染色体等数据，不同研究者的结果不尽相同。后来研究者建立了基于减数分裂粗线期染色体的细胞学分析技术[68]，解决了体细胞染色体过短的问题。但传统的粗线期染色体制片技术难度较大，需要发展更简单有效的方法准确识别不同染色体，推进水稻的细胞遗传学研究。

　　3甜瓜属是葫芦科重要的属，包含52个物种，其中包括两个重要的经济作物，即从大约100亿年以前的一个相同祖先分化而来的黄瓜(CucumissativusL.,2n=14,367Mb)和甜瓜(C.meloL.,2n=24,450Mb)[90]。甜瓜属物种染色体相对较小，细胞遗传研究起步较晚。甜瓜属包括许多重要的野生种，具有栽培黄瓜和甜瓜所需的多种优良性状，开展细胞遗传研究，阐明物种间的进化关系，对于挖掘和利用野生种的优良性状基因，推进甜瓜属作物品种改良具有重要意义。

　　3.1甜瓜属染色体鉴定技术甜瓜属中黄瓜细胞遗传学研究相对较多。黄瓜中期染色体较小，传统细胞学技术难以准确描述和识别黄瓜染色体，染色体分带技术在黄瓜染色体鉴定中起到了不可替代的作用，其中以C带在黄瓜中应用最为广泛。Chen等[91]利用改良的染色体制片技术和C带技术建立了黄瓜的有丝分裂中期染色体核型，但黄瓜中期染色体较短，C带分辨率不高，难以准确识别黄瓜每条染色体。钱春桃等[92]采用放线菌酮预处理活体种子根改进制片技术，获得了清晰的黄瓜前中期染色体C带带型。

　　4棉花(Gossypzumhirsutum,2n=4x=AADD=52)是重要的纤维作物，也是重要的植物油脂和植物蛋白质来源。目前世界上广为栽培的棉花为异源四倍体种，为纺织工业提供了90%以上的棉纤维。棉属有52个种，包括45个二倍体种，根据亲缘关系分成A-G和K等8个基因组(其中2个为A组栽培种)以及7个由AD基因组组成的异源四倍体种(含2个为栽培种)，是改良栽培棉花的重要基因资源，通过远缘杂交转移和利用外源基因对于棉花改良有重要意义。

　　4.1棉花染色体鉴定技术

　　棉花染色体数量多，形态相似且较短小，未建立染色体分带等核型分析技术，因而难以准确识别特定染色体。GISH技术提供了有效鉴定手段。以野生种斯特提棉(G.sturtianumWillis)为探针，在陆地棉(G.hirsutumL)标准系TM-1体细胞有丝分裂中期染色体上进行GISH，可以鉴定出栽培棉中的外源染色体[111]。以A1基因组的阿非利加草棉(G.herbaceumLvar.africanum)和C1基因组的斯特提棉两个棉种的DNA同时为探针进行GISH，可以清晰地区分At、Dt和C1基因组染色体，且重复性好，这一棉花多色GISH技术体系成功应用于种间杂种的鉴定[111]。对引自澳大利亚CSIRO的陆地棉与澳洲棉(G.australeF.v.M.)(G2基因组)六倍体杂种(基因组组成为AtAtDtDtG2G2)进行的多色GISH，可清晰地区分At、Dt和G2基因组染色体[111]。

　　Wang等[112~114]开发了基于棉花连锁群(染色体)的特异BAC克隆，获得第一套多倍体植物四倍体棉染色体特异的BAC克隆，利用BAC-FISH杂交信号可作为染色体特异的细胞学标记，准确地识别出棉花26条染色体。Wang等[114]利用棉花高密度遗传图谱的SSR分子标记筛选出了20个BAC克隆，与45S和5SrDNA相结合，构成了由22个探针混合形成的鸡尾酒式文库，以亚洲棉江陵中棉有丝分裂中期染色体为靶标，一次FISH产生的信号可以同时识别亚洲棉的13对染色体，且与陆地棉A染色体亚组的部分同源染色体一一对应，获得了亚洲棉稳定可靠的标准核型，实现了亚洲棉染色体的准确识别。

　　植物方向论文范例：植物精油对提高葡萄抗寒性的影响研究

　　5菊科(Compositae)春黄菊族(Anthemideae)菊属(Chrysanthemum)的菊属约有43个种和18个变种(亚种)，它们以染色体基数9形成一个从二倍体到十倍体的多倍体系列。其中菊花(C.morifoliumRamat.)为多年生草本植物，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，观赏和经济价值极高。栽培菊花大多为六倍体及非整倍体，具有高度杂合、自交不亲和及近交衰退等特性。我国是栽培菊花的起源中心，但原有商业主栽品种多为国外引进，抗蚜虫性、耐低/高温性差和种性退化等成为限制我国菊花产业发展的瓶颈。开展菊花分子细胞遗传学研究对于探究菊花起源与演化、菊属种间亲缘关系以及利用远缘杂交拓宽菊花遗传基础具有重大意义。

　　作者：王海燕1，龚志云2，蒋甲福1，周宝良1，娄群峰1，曹清河3，席梦利4，陈佩度1，顾铭洪2，张天真6，陈发棣1，陈劲枫1，李宗芸5，王秀娥1*