蛋白质-蛋白质相互作用的实验检测方法

　　　摘要：生物体内的蛋白质分子常常通过与其他蛋白质分子发生相互作用来发挥其生物功能.因此，研究蛋白质-蛋白质相互作用(protein-proteininteraction，PPI)对于阐明蛋白质分子的生物功能以及分子作用机理具有重要的意义.主要介绍基于生物物理和生物化学原理的检测蛋白质-蛋白质相互作用的实验研究方法，并对发展趋势做出展望.

　　关键词：蛋白质-蛋白质相互作用;生物物理方法;生物化学方法

　　蛋白质是生命体的重要组成部分，是生命活动的主要承担者和执行者.人类基因组由20000￣30000个可编码超过50万种不同蛋白质的基因组成W.随着人类基因组计划的完成，旨在研究全基因组水平上所有蛋白质的表达、结构以及功能的蛋白质组学已然成为后基因时代的研究热点.据估计，超过80%的蛋白质并不是孤立存在，而是与其他蛋白质通过相互作用形成稳定或瞬时的复合物结构%蛋白质-蛋白质相互作用(protein-proteininteractions，PPIs)是分子生物学中最重要的现象之一，几乎在所有的生命过程如细胞通讯、代谢、转运、信号转导、免疫应答和基因转录中，都起着核心作用.通过研究蛋白质-蛋白质相互作用，可以探究蛋白质在生命过程中的作用以及发挥功能的机制，更好地理解生命过程.

　　因此，对蛋白质-蛋白质相互作用的研究，已成为生命科学研究的热点之一W.蛋白质-蛋白质相互作用是生物分子网络中的基本组成元件，但是异常的蛋白质-蛋白质相互作用很有可能会导致肿瘤的发生和发展.因此，蛋白质-蛋白质相互作用的位点也成为新兴的一类药物IE点，例如G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors，GPCRs)、核激素受体、离子通道和酶等叭癌症、心血管疾病、免疫系统疾病等均有以靶向蛋白质-蛋白质相互作用的研究，如细胞色素c-细胞色素c氧化酶[61、?0-1-?0-1^71、人卩￡1-116【-，1、MDM2P53@等.

　　因此，研究PPIs为开发治疗疾病的新药提供了更多机会随着蛋白质组学的飞速发展，用于表征蛋白质-蛋白质相互作用的方法相继提出。比较传统的技术方法有荧光偏振、核磁共振、酵母双杂交和免疫共沉淀等.近年来新发展的方法包括生物膜干涉技术、微量热泳动(microscalethermophoresis，MST)技术、AlphaScreen和蛋白质片段互补分析技术等.表1中总结了9种基于生物物理和生物化学原理，并被广泛用于表征蛋白质-蛋白质相互作用的常用实验技术以及近年来发展的新检测方法.

　　1基于生物物理原理的检测方法

　　1.1表面等离子共振表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)是一种基于物质间相互作用所导致芯片表面质量变化而产生的一种光学现象。目前，SPR生物传感器已经广泛用于研究生物分子间的相互作用，可以对蛋白质-蛋白质相互作用进行实时、无标记检测.

　　SPR的原理 来衡量.传感器表面与待研究蛋白质之间的界面是传感器系统的重要组成部分，一般购买商业芯片，其中包括通过氨基偶联的CM5芯片、用于固定His标签蛋白的NTA芯片和用于固定生物素化蛋白的SA芯片.与荧光或酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)相比，SPR技术具有很多优点：①测量基于折射率的变化，分析物不需要任何标记，可直接检测;②测量可以实时进行，研究人员能及时获得动力学数据和热力学数据;③作为一种多功能技术，能够检测各种分子量的蛋白质.

　　基于以上特点，SPR已成为研究生物分子间相互作用的有力工具#1.以MDM2-P53的相互作用为例，Wu等采用双通道SPR传感器测定在肉瘤组织提取的游离态和与P53结合的MDM2的水平，为了获得更高的灵敏度和特异性，使用MDM2特异单克隆抗体(2A10)识别游离态和与p53结合的MDM2，发现由肉瘤组织提取的游离态和总MDM2(游离和结合形式组合)蛋白质的浓度比正常组织提取的高，并且与P53结合的MDM2蛋白质仅占总MDM2浓度的一小部分.

　　但是，SPR技术的缺点是难以区分实验过程中的非特异性吸附，对实验结果造成影响.传统的SPR技术限于低通量研究，因为标准SPR生物传感器仅在单个传感器芯片上包含3￣4个流动池.如今随着技术的革新，表面等离子共振成像(surfaceplasmonresonanceimaging，SPRI)正在向高通量筛选(high-throughputscreening，HTS)发展.结合蛋白质阵列技术和电荷親合器件(charge-coupleddevice，CCD)相机，并根据反射光的强度制作图像，SPRI已经发展到能同时处理成千上万个样本[1Q，13].

　　1.2生物

　　膜干涉生物膜干涉(biolayerinterferometry，BLI)是近年来新发展起来的一种基于光干涉量度法的检测技术，可用于实时、快速、以非标记方式分析生物分子之间的相互作用.BLI技术 将相互作用的生物分子之一通过氨基偶联、生物素/链霉亲和素、组氨酸标签/镍离子螯合剂等方式固定于光纤制成的生物传感器末端，形成生物膜层.当一束可见光垂直入射生物膜层时，光在生物膜层的两个界面反射后形成一束能被光谱仪检测到的干涉光谱.当固定分子与溶液中的分析物发生相互作用时，生物膜层厚度发生变化，通过检测干涉现象的相位移动，从而能够分析结合到传感器上的分子数量的变化I14-15].

　　BLI技术的应用十分广泛，可以检测生物分子之间是否存在特异性结合.研究人员已将BLI技术广泛用于蛋白质-蛋白质相互作用的研究，如Pogoutse等M利用BLI技术测定两组蛋白质相互作用对Mms2/Ubcl3、铁转蛋白/TbpB间的结合常数.该工作采用了链霉亲和素固定的方式，目标蛋白在体内实现生物素酰化过程，随后以细胞裂解液取代纯化的蛋白，通过BLI测得结合常数，既经济又省时.

　　BLI技术具备实时监测、非标记、高通量、快速检测等优点，可检测亲和力为1(T1Q￣104mol/L的相互作用，并且可提供结合的亲和力ifD值及动力学信息.相比表面等离子共振的微流控系统，BLI技术侵入即读的检测手法更为简便，且实验结果不受样品折射率影响，但是实验过程中需要注意分析物是否与生物膜层存在非特异结合.另外，样品缓冲液中所包含的部分去垢剂可能形成非均匀胶束，从而引起生物膜层非均匀性厚度变化，对检测结果产生影响[15]+

　　1.3微量

　　热泳动MST技术可以检测分子在微观温度梯度场中的定向运动，因此也被称之为热泳动.定向运动现象对由结合引起的分子大小、电荷、构象或水化层的细微变化十分敏感，因而可以用来研究蛋白质-蛋白质之间的相互作用MST技术示意.

　　实验过程中，对相互作用的蛋白质分子其中之一进行荧光标记，以溶液形式均匀分布于毛细管中.随后，毛细管在红外激光照射下形成局部温度梯度，标记分子因热泳动作用力而远离加热区域，经历温度跃迁(T-jump)后达到稳定态.在关闭激光后，标记分子经历逆向温度跃迁和反向扩散后，恢复到均匀分布的状态[18_2Q1.

　　上述这一过程会受到由结合引起的分子大小、电荷或水化层变化的影响，因而通过逐步滴定与标记分子相互作用的蛋白质，MST技术可用来测定蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数[21_221MST技术可以很容易地测量蛋白质结合的过程，目前越来越多地应用于与疾病相关的蛋白质相互作用的研究中，从而揭示疾病发生的分子机制.

　　例如，纤毛结构或者长度的失调会引发疾病.纤毛的前体微管蛋白(tubulin)在纤毛内运输与两个关键蛋白质IFT74和IFT81有关.Bhogaraju等网利用MST技术研究人类重组IFT81、IFT74与牛的ap-tubulin之间的偶联特征，实验发现IFT74/81复合物比单独IFT81与tubulin的结合力大大增强，证明了与tubulin相偶联的模块是由IFT74/81复合物组成，而不是单独的IFT81.

　　MST技术相比与其他体外结合实验的优势在于：①样品无需固定处理;②样品用量少，可对|iL级的溶液进行检测;③对相对分子质量没有限制;④可以进行快速检测，结合活性实验可在10min内完成测定;⑤可以测定pmol/L级的亲和活性.此外，MST技术可以对复杂的生物体系如细胞裂解液、血浆等进行测定[241+通常，MST技术需要荧光团标记蛋白质分子.

　　2基于生物化学原理的检测方法

　　2.1荧光共振能量转移萤光费振能慧转移(fiuOTes御wreson阳wenergytra取fer，遍指荧光供体在受到激发光激发后不发射出光予而将激发的能纛转移到荧光受体上的现象(见_2(&))!夠.在对蛋白质-蛋白质相S作用的研究中，分子MFHE1T仅在荧光供体和受体相距非常近即形成复合物时发1喪.

　　因此，要产生FRET现象#要满足3个条件：①供体发射光谱与受体激发光谱有重叠;@荧光供体和受体之间的距离在10nmoI/L范围内;@H共体与受体之间迀移偶极子的方向平行^目前，广泛用子供体与受体标记的荧光染料来自于録色荧光選白(gremifluoreseeBtpmfeiii，GFF)的突靜体包播青色貴光：蛋自-脅色養光蛋：自柄fluorescentprot#n，jr沾ftuor傲centprotein，网、蓝色獎光蛋白-Gl?'P(bh^fluoreseeiitprotein-GPP，BrP-GEPJ?，CyPet-YpetW%Sffij^iriK〇M，OfPP-YFP。

　　随着对FRET方法的优化，该技术已被广泛应用于体外测定结合活性并筛选氧歲质-蛋白质相II作用抑制剂蛋：白被小1纖泛素样修饰物(flliallubi职itin-Bketiodi細r，SIJ域O)修愤鳥：真核坐物界的蓠粟修饰：途轻.SUMO可以组装成寨合链，与食賣两个SCMO相瓦作用：基■(SUMO-城_流通motif，SIM)：的受体蛋白，质粗结氣从而对爱体蛋：：白货：进行修饰.Kost等设计了一种FRET传感器，用于测定SUMO线處=聚体与包含SIM蛋白质的结合，利用%来酰亚胺和铜催化的点击化学反应将合成受体和供体的染料偶联到SUMO亚基上，在多个进M配体存棚情況下监测PftlT变化.因此;开发PIET传感器对于研究SCIMO-SIM：的相S作用具有￥常重要的价值.

　　3结束语

　　近年来表征蛋白质-蛋白质相互作用的新技术、新方法不断涌现，并向高灵敏度、高通量的方向发展.根据研究目标的不同以及蛋白质自身的特点，选择合理的检测方法十分重要.若要定性表征蛋白质分子间是否存在相互作用，可以选择传统的拉下法、TAP、Co-IP等方法进行检测;若要定量测量蛋白质分子间的相互作用，可以选择MST，SPR，PLI等方法进行检测;若要进行高通量的研究，可以选择FRET，AlphaScreen，PCA等方法进行检测.所有方法都有其自身的局限性，可能在检测中出现假阳性或假阴性的结果.

　　生物方向评职知识：蛋白质工程论文发表指导

　　因此，应该使用基于不同原理的技术方法相互验证，以获得更为可靠的结果.同时，不同技术方法的联用可弥补单种技术的不足.例如，借助质谱的高灵敏度、高通量的优势，亲和层析可以与质谱(massspectroscopy，MS)联用(即AP-MS)鉴定与目标蛋白质相互作用的蛋白质，以获得更完整的信息.随着技术方法的持续进步，在蛋白质-蛋白质相互作用研究领域将会更广泛地应用上述技术.预计检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术将向高通量方向发展，并将会产生大量的实验数据，因此需要发展更强大的生物信息处理工具将原始数据转化成有用的信息.

　　参考文献：

　　[1]BerggardT，LinseS，JamesP.Methodforthedetectionandanalysisofprotein-proteininteractions[J].Proteomics，2007，7：2833-2842.

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　　作者：孔文娜，周宓2，林海霞王任小2