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我国植物蛋白饮料掺假检测技术研究现状

时间:2020年06月16日 所属分类:农业论文 点击次数:

摘要:蛋白饮料掺假现象是影响植物蛋白饮料行业健康快速发展的制约因素之一。本文综述了植物蛋白饮料掺假的主要检测技术,包括光谱技术、聚合酶链式反应技术、质谱技术等,从快速性、经济性、准确性和可靠性比较了这些检测技术的优缺点,以期为植物蛋白饮料

  摘要:蛋白饮料掺假现象是影响植物蛋白饮料行业健康快速发展的制约因素之一。本文综述了植物蛋白饮料掺假的主要检测技术,包括光谱技术、聚合酶链式反应技术、质谱技术等,从快速性、经济性、准确性和可靠性比较了这些检测技术的优缺点,以期为植物蛋白饮料掺假鉴别提供参考和依据。

  关键词:植物蛋白饮料;掺假;检测技术

粮食与油脂

  植物蛋白饮料是指以植物果仁、果肉及大豆为原料(如大豆、花生、杏仁、核桃仁、椰子等),经加工、调配后,再经高压杀菌或无菌包装制得的乳状饮料,比如豆奶、核桃露、花生露、杏仁露和椰子汁等[1]。植物蛋白饮料富含蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质和粗纤维,不含或含较少的胆固醇,具有很高的营养价值[2]。近几年,随着消费者对食品安全、健康饮食越来越关注,且由于植物蛋白饮料具有天然、绿色、营养、健康的品类特征,逐渐受到广大消费者的青睐[3]。

  植物方向论文投稿刊物:《粮食与油脂》的主要内容有粮油新产品开发、粮油加工、粮油资源利用、粮油生物工程、粮油检测、功能性食品、食品添加剂、粮油市场、行情分析、市场评论、国际粮油食品信息等。

  2007年以来各饮料子行业增速最快的是植物蛋白饮料,2007~2016年在整个饮料行业的占比上升8.79个百分点至18.69%。2016年植物蛋白饮料制造业市场规模占比最高,植物蛋白饮料行业收入为1217.2亿元。2015年,我国植物蛋白饮料零售市场零售额达到729.28亿元,市场总销量为58.43亿升。预计到2020年,零售额达到1393.5亿元,总销量增至107.97亿升[4]。

  由于经济利益的趋势,不法商家将价格低廉的植物原料掺入产品当中欺骗消费者,如在核桃饮品中掺入价值远低于核桃的花生、大豆成分[5]。这种掺假行为不仅损害了消费者的经济利益,还对消费者的健康造成严重威胁。若消费者对掺入成分过敏,该消费者在不知情的情况下误食后可能会产生过敏反应[6]。因此,为打击植物蛋白饮料掺假行为、保证食品安全、促进国际贸易,食品安全监管部门需要建立一系列方法来检测和鉴定植物蛋白饮料是否掺假使假。

  1植物蛋白饮料掺假检测技术

  1.1理化检测技术

  张敬敬[7]等研究了核桃乳掺假鉴别方法,并通过利用气相色谱法测定核桃乳样品中山嵛酸的含量鉴别核桃乳中是否掺有花生乳,还利用高效液相色谱法测定样品中是否含有大豆异黄酮来鉴别核桃乳中是否掺有大豆乳,在核桃乳中掺入10%的大豆乳和花生乳即可被测定出,且回收率在80%以上。夏君霞[8]等将不同配比的核桃花生乳和核桃杏仁乳甲酯化后,利用气相色谱仪分析了其脂肪酸含量,并根据核桃仁、花生仁、杏仁中的特征脂肪酸,利用面积归一法分析,表明在核桃花生乳中亚麻酸含量、花生酸与山嵛酸含量之和、油酸与亚油酸含量之比是随着核桃仁添加量的变化呈线性变化,在核桃杏仁乳中亚麻酸、油酸、亚油酸含量同样是随着核桃仁添加量的变化呈线性变化。

  因此,根据样品脂肪酸组成可以推断核桃乳中是否添加了花生或杏仁,以及添加比例,但是该过程前处理过程复杂,且气相色谱程序升温时间较长,脂肪酸成分复杂,数据分析过程较耗时。植物蛋白饮料标准中规定了部分脂肪酸占比要求,例如杏仁蛋白饮料的执行标准GB/T31324—2014《植物蛋白饮料杏仁露》中规定,棕榈烯酸占总脂肪酸的百分比≥0.50%,花生酸和亚麻酸之和占总脂肪酸的百分比≤0.24%,其本意即为控制在杏仁蛋白饮料中过度使用其他植物蛋白质原料(如花生和大豆),但是部分厂商可能以脱脂的花生蛋白粉或大豆蛋白粉规避现有产品标准的监测,因此,脂肪酸组成测定过程不能作为蛋白饮料是否掺杂的单一方法。

  1.2红外光谱技术

  红外光谱技术在食品农产品领域中的应用越来越广泛[9-11],其优势在于其具有快速、无损、环保等优点,能有效区分复杂的混合物,提取可靠的光谱信息,随着化学计量学的发展,结合适当的光谱预处理及建模方法,可以有效去除噪声,解决光谱共线问题,得到准确可靠的预测模型[12]。

  范睿[13]等研究了利用近红外光谱分析仪测定自行配置不同浓度的植物水解蛋白掺假牛奶,应用SabIR漫反射模块直接扫描掺假样品,同时使用Antaris透射分析模块扫描三氯乙酸前处理的掺假样品,应用TQAnalyst软件使用最小二乘法(CLS)、逐步多元线性回归(SMLR)、主成分回归(PCR)和偏最小二乘回归(PLS)分别建模,通过一阶导数、二阶导数、SG平滑和Norris平滑对红外光谱图进行预处理,以校正均方差、预测均方差和相关系数为指标比较了两种方法差异。

  结果表明PCR建模方法可以解决部分共线性问题,对光散射和组分之间干扰做出补偿,同时选择一阶导数放大有效信息分离重叠信息和NorrisDerivative滤波平滑被放大的噪音信息,以提高信噪比。此条件下,透射采集植物水解蛋白定量分析模型和漫反射采集植物水解蛋白定量分析模型都可以对牛奶中的植物水解蛋白含量定量分析。近红外光谱可以应用于花生牛奶的定量分析,为花生牛奶提供产品质量控制和快速定量检测,为植物蛋白饮料掺假提供一种新的检测思路,但是红外光谱分析灵敏度相对较低,需要大量代表性且化学值已知的样品建立模型,且模型需要不断更新,建模成本高,因此,其应用具有使用局限性。

  1.3酶联免疫分析技术

  (ELISA)酶联免疫吸附试验(ELISA,enzymelinkedim-munosorbentassay)的基本原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后加入与酶反应的底物,底物被酶催化成有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,借助分光光度计的光吸收进行定性或定量分析。酶联免疫检测方法有双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法等,具有特异性强、敏感度高、操作简单等优点。

  其中双抗夹心法是经典的蛋白质检测免疫反应模式,该方法以一个包被在酶标板的抗体捕获抗原,另一带标记的抗体再结合抗原的第2个决定簇,具有特异性高、反应灵敏等优势,然而热处理会使部分蛋白质水解,从而导致抗原的2个决定簇解离,丧失结合双抗体的能力。竞争法中1个抗原分子只结合1个抗体,即使被水解,只要抗原决定簇不受破坏仍然可被抗体识别,可以较好地应用于热处理蛋白质的检测。

  张世伟[14]等利用竞争酶联免疫法分析(ELISA)了杏仁饮料中杏仁蛋白质的含量,其首先使用双向电泳和MALDI-TOF/MS确定了杏仁中的蛋白质定量标志物-Pru-1蛋白,同时通过切胶回收方法分离纯化了杏仁40kuprunin蛋白α链,并以此作为抗原制备了抗杏仁蛋白单克隆抗体,使用该抗体建立了检测杏仁蛋白质的竞争酶联免疫分析方法,作者研究了该方法的特异性,结果表明该方法以杏仁可溶全蛋白作为标准品,IC50为19.6μg/mL,线性范围为5.0~100μg/mL(R2=0.990),方法特异性良好,抗体只识别Pru-1的α链,与包括羽扇豆和玉米在内的其他种子蛋白和乳蛋白无交叉反应。作者利用该方法对从市场随机购买的5份杏仁蛋白饮料中的蛋白含量进行检测,4份样品与凯氏定氮法结果一致,且植物蛋白饮料样品的检出限为0.6mg/mL,相对标准偏差<10%。

  同时研究了热加工对该法测定杏仁蛋白质含量的影响,结果显示使用巴氏杀菌、超高温瞬时灭菌和高压灭菌的蛋白质平均回收率分别为96%、92%和81%,该方法可以准确地测定超高温瞬时灭菌的杏仁露中杏仁蛋白质含量,但是高温长时间的热加工会对该方法产生一定影响。但是热加工蛋白质的定量一直以来就是免疫学定量的难题,由于蛋白质在热加工中会发生变性、水解、聚集等作用,从而导致蛋白质的沉淀和抗原决定簇的破坏,严重影响到定量的准确性。

  1.4分子生物学技术

  在食品安全检测领域,应用较为广泛的分子生物学技术主要包括聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术、DNA条形码技术和实时荧光PCR技术等。常规PCR技术灵敏度高、特异性好,DNA条形码技术成本低、快速可靠,均被广泛用于食品中进行定性检测;实时荧光PCR技术不仅可用于定性检测,还可测定循环阈值(Ct)值和初始DNA模板浓度进行相对定量[15,16];微滴式数字PCR(dropletdigitalpolymerasechainreaction,ddPCR)是准确定量核酸的一门新兴核酸扩增技术[17,18],其利用有限稀释分析和泊松分布分析来实现靶DNA拷贝数的绝对定量[19-21],被称为“第三代PCR”技术[22]。

  韩晴等利用植物DNA条形码技术与PCR技术[23],设计、筛选了同时能对杏仁、花生、核桃、大豆、芝麻和榛子六个物种进行扩增的通用引物,并将其应用于杏仁露中花生源性成分的检测,结果表明引物ITS2-2和trnH-psbA-1分别对六个物种的扩增成功率和测序成功率均较高;并通过计算杏仁、花生的基因组DNA提取率,设计掺假模型在提取的杏仁基因组DNA中掺入花生基因组DNA,引物ITS2-2对于掺入85.80%的花生检测结果为杏仁,trnH-psbA-1对于掺入6.94%的花生检测结果为花生,引物ITS2-2和trnH-psbA-1可作为鉴别杏仁露中花生源性成分的植物DNA条形码组合。

  周巍等起草的植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定(BJS201707)食品检验方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法[24],适用于核桃露(乳)、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定,但是该方法对植物源性成分无法定量。杨硕等利用PCR方法检测了椰子汁中椰子种源成分[25],发现UBC10基因适用于椰子汁类产品的靶向扩增,同时利用实时荧光PCR验证了大豆、花生等的源性成分引物、探针特异性,发现6个种源间无交叉反应,无非特异性扩增曲线。

  作者利用实时荧光PCR技术检测了6份椰子汁中植物源性成分,其中2份样本检出大豆成分,且利用特异性、灵敏度更好的ddPCR进行了验证,由于一方面反应体系中存在的抑制剂抑制了PCR反应,加上样本基质复杂,荧光背景高,易造成假阴性或假阳性;另一方面抑制剂能影响DNA聚合酶的外切酶活性,导致水解探针的特异性变差,发出非特异性荧光,造成假阳性,而ddPCRSuper-Mix优化了DNA聚合酶稳定性和耐抑制剂能力,无限稀释的反应体积削弱了复杂基质对反应的抑制效应,能够弥补实时荧光PCR容易错判可疑结果的缺陷。分子生物学方法灵敏度高、重复性好,用于植物蛋白饮料掺假检测,有效保护植物源性成分过敏人群,打击制假掺假的不法商家,保护消费者权益。

  1.5液相色谱质谱联用技术

  基于蛋白质组学的研究发现,组织中存在一些蛋白质,其含量与总蛋白质含量有比较稳定的比例关系,可作为蛋白质定量标志物[26,27]。因此,通过对这些蛋白质定量标志物的测定即可推算出物种的总蛋白质含量,实现物种蛋白质含量的特异性定量。液相色谱质谱联用技术(Liquidchromatogra-phy-massspectrometry,LC-MS)将色谱对复杂样品的高分离能力,与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来,已广泛应用于医药、环境和食品安全领域中,特别在食品领域中,诸如食品农兽药残留、添加剂、成分分析和过敏源等。蛋白通过LC-MS的色谱分离和质谱的碎裂分析,得到大量肽段信息,通过数据库查询分析这些肽段可以对蛋白进行鉴定。

  JosephineBnick,GerdHuschek,HarshadraiM.Rawel等[28]人利用液相色谱串联质谱技术对面包产品中的小麦、斯佩耳特小麦和黑麦的真实性进行了检测,最终利用通用蛋白数据库Blast比对筛选出了三种小麦的特异性肽段,并利用这些特异性肽段对面包中的小麦、斯佩耳特小麦和黑麦含量进行了定性定量分析。该技术是一种稳定、灵敏、特异的追溯蛋白物种来源的新方法,同时构建肽库,利用蛋白组学、代谢组学等方法研究植物蛋白已经成为发展趋势,随着离子化、质量分析检测的不断完善和发展,液质联用技术必将成为植物蛋白分析的最有效工具[29]。

  2植物蛋白饮料掺假检测方法比较

  植物蛋白饮料掺假检测技术有前面所述如理化检测技术、红外光谱技术、酶联免疫分析技术、分子生物学技术和液质联用技术等众多方法,根据这些检测方法的特点(包括快速性、经济性、准确性、可靠性四个方面)进行总结与比较。各种测定方法的特点各不相同。

  其中红外光谱技术具有明显的快速、经济无损等优点,但是其建模过程复杂且样品基质复杂,分析结果的准确性和可靠性较低;酶联免疫分析技术成本稍高,且热加工工艺对检测结果影响较大;分子生物学方法和液质联用测定蛋白多肽技术优点很突出,是所有方法中最准确可靠的,但是缺点也很明显,即成本较高,其中PCR方法无法对掺假比例进行准确定量,而液质联用技术可以实现目标多肽和蛋白质的定性定量测定。随着蛋白组学的发展及随着各种离子化、质量分析检测及联用技术的不断完善和发展,利用LC-MS技术对植物蛋白和肽的鉴定、定性定量分析必将成为植物蛋白研究的重要手段之一。

  3结论与展望

  随着科学技术的日益发展以及高尖端技术的出现,对于植物蛋白饮料掺假的检测技术已经由主观的感官检测向客观的科学分析手段发展,由简单的定性检测发展为定量检测。然而,面对多种多样的掺假现象以及不断发展的掺假手段,我国目前尚未建立足够的检测标准,而且传统的理化检测方法和酶联免疫分析法又存在费时、费力以及受原料加工方式和条件等因素影响,难以做到鉴伪方法的广泛适用性。

  假冒伪劣商品的存在需要高科技、先进鉴伪技术的产生,随着蛋白质组学、分子生物学和质谱技术的发展,特别是液质联用技术在蛋白质和多肽领域的应用,弥补了常用的化学检测技术的诸多不足,为检测技术的发展开辟了新的领域,通过大量的实践,不断完善和发展该检测技术,扩大其检测范围,为进一步规范产品市场,进一步支撑食品安全监管提供有益的技术资源。

  参考文献

  [1]GB16322—2003,植物蛋白饮料卫生标准[S].

  [2]张秀红,李琪.植物蛋白饮料的营养、加工及发展前景[J].山西师范大学学报:自然科学版,2001,15(2):60-66.

  [3]孙克江,张甜,曲梅丽,等.聚丙烯酰胺凝胶电泳法快速检测植物源性食品中蛋白成分[J].食品安全质量检测学报,2017,8(3):895-899.

  [4]前瞻产业研究院.2018-2023年中国植物蛋白饮料行业市场需求与投资规划分析报告[R].深圳:前瞻产业研究院发布,2018.

  [5]丁清龙,曾晓琮,周露,等.广东省植物源性饮料掺假情况摸底调查[J].食品安全质量检测学报,2018,9(12):2953-2957.

  [6]赵益菲,布冠好,左颖昕.植物蛋白过敏原及其物理脱敏方法的研究进展[J].粮食与油脂,2017,30(5):8-11.

  [7]张敬敬.核桃乳掺假鉴别技术研究[D].河北:河北科技大学,2013.

  作者:张淑霞,李珂,祝伟霞,王向军,刘军红