基于抗炎生物效价的甘草传统感官评价科学性研究

　　[摘要] 目的：通过整合分析甘草抗炎活性与性状特征数据，研究感官评价的科学性。方法：基于核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(NLRP3)炎症小体细胞模型，建立甘草的抗炎生物效价测定方法，通过测定生物效价将采集的甘草样品分级。通过电子鼻、色彩色差仪等方法采集不同等级甘草样品的性状信息，通过主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析不同等级甘草的差异性，并进一步考察性状特征与甘草抗炎活性关联性。结果：实验结果显示甘草提取物对尼日利亚菌素诱导的小鼠原代骨髓巨噬细胞 NLRP3 炎症小体的激活具有明显抑制作用，根据甘草的抗炎生物效价，可将 10 批次甘草分为两个等级，一等甘草的生物效价在 5.949~11.418U·mg–1 之间，二等甘草的生物效价在 1.575~1.887 U·mg–1 之间;PCA 结果显示两等级甘草可以聚成两类;OPLSDA 结果显示 R2X=0.534，R2Y=0.863，Q2=0.75，模型的拟合能力较好，预测能力较强，并且发现色度值 b*和断面直径 2R 的 VIP 值分别为 1.542 94、1.260 11，均大于 1，两者可能是导致两等级甘草药效差异的关键参数，经过实测值比较，两等级甘草在 b*上存在显著性差异。结论：研究表明，甘草的色度值 b*与甘草抗炎活性具有显著的相关性，是其质量评价的一个重要指标，也佐证了甘草传统评价具有一定的科学性。

　　[关键词] 甘草;感官评价;核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3;炎症小体;主成分分析;正交偏最小二乘法

　　甘草来源于豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草 G. inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎[1]，是中药大品种之一，在中药应用中具有十分重要的地位，被誉为中药中的“国老”。甘草质量是其临床疗效的保证。感官评价是甘草质量评价的一种重要方法，主要是根据药材的形、色、气味、断面等性状信息来判断质量的优劣，这种质量评价方法来源于古代临床应用的总结，具有直观简便[2]等优势。

　　但是由于这种传统的评价方法存在主观性较强等问题，其是否还适用于现代的甘草质量评价，能否准确反映其临床活性的差异性有待进一步探讨。甘草调和诸药，在临床上应用广泛，具有抗炎、保肝、调节免疫等多种药理活性[3]。现代研究表明，多种疾病的发生和发展都伴随着炎症的产生[3-6]，抑制炎症反应是甘草发挥多种药效作用的共性特征。因此，抗炎可能是甘草质量评价的一个重要指标。炎症小体是炎症反应的重要组成部分，与众多炎症性疾病以及免疫性疾病密切相关，包括黑素瘤缺乏因子 2(AIM2)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(NLRP3)、NLR 家族 CARD 结构域包含蛋白 4(NLRC4)等[7]。

　　NLRP3 炎症小体是它们中最具有特点的一种，能够被多种刺激剂(如尼日利亚菌素、三磷酸腺苷等)激活，也因此成为目前国内外研究最广泛、最深入的一类炎症小体，激活后的炎症小体可通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)对白介素-1β(IL-1β)及白介素-18(IL-18)前体物质进行水解，最终产生并释放活性 IL1β、IL-18 炎症因子，介导炎症反应的发生[8]。本研究借助现代测量工具及分析仪器，将甘草的性状特征定量化，与根据抗炎生物效价分级后的甘草样品进行整合分析，考察各性状特征与抗炎活性的关联度，旨在考察甘草传统感官评价能否准确地反映其抗炎活性，以期为甘草感官评价的实际应用提供参考，并为其科学性提供数据支持。

　　1 材料

　　1.1 仪器CM-5 型色彩色差仪

　　(日本柯尼卡美能达公司);FOX 3000 型电子鼻系统(法国 Alpha MOS 公司);聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)系统、TC10 型自动细胞计数仪均购自美国 Bio-Rad 公司;洁净工作台(北京冠鹏净化设备有限公司);台式高速离心机、恒温二氧化碳培养箱均购自美国 Thermo公司;HW·SY11-K 型电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司);KQ-500DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);OV200 型台式真空冷冻离心浓缩仪(北京吉艾姆科技有限公司);立式压力蒸汽灭菌器(重庆雅马拓科技有限公司);微量移液器(德国 Eppendorf 公司);PromegaGloMax 20/20 型发光检测仪(美国 Promega 公司)。

　　1.2 材料与试剂

　　C57BL/6 雌性小鼠 2 只(9~11 周龄)，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物伦理审查编号为 IACUC-2020-0037。DMEM 培养基(批号：K0111200)，磷酸缓冲盐溶液(PBS，批号：K0911200)，乙二胺四乙酸(EDTA，0.5 mol·L–1，批号：K1905010)，胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA 消化液(0.25%，批号：K1207050)，均购自美国 Macgene 公司;opti-MEM 培养基(批号：31985070，美国 Gibco 公司);巨噬细胞集落刺激因子(M-csf，批号：#87394，美国 MedChemExpresss 公司);胎牛血清(FBS，批号：2037144，以色列 Biolnd 公司);尼日利亚菌素(Nigericin，批号：HY100381)，脂多糖(LPS，批号：tlrl-ppglps)，均购自美国 Invivogen 公司;二甲基亚砜(DMSO，批号：No.1121E0327，德国 Sigma-Aldrich 公司)。

　　IL-1β ELISA 检测试剂盒(批号：2018-3，北京达科为生物技术有限公司);CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(批号：0000418489)，CaspaseGlo®1 Inflammasome Assay(批号：0000443211)均购自美国 Promega 公司。NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)及 Caspase-1 抗体均购自美国 Adipogen 公司;IL-1β 抗体购自美国 R&D 公司;辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠 IgG 抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 抗体购自美国 Santa Cruz 公司。10 个批次甘草样品编号 S1~10，批号分别为 S1(J180228001)、S2(H190077001-3)、S3( 20032604 ) 、 S4 ( H190080001-3 ) 、 S5 ( H190074001-3 ) 、 S6 ( H190078001-3 ) 、 S7(C200015001)、S8(J170042001)、S9(H190075001-3)、S10(CA180140001)，经解放军总医院第五医学中心肝病研究所肖小河研究员鉴定均为乌拉尔甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch。

　　2 方法

　　2.1 供试品的制备按照

　　《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020 年版方法[1]制备甘草提取液，抽滤，精密吸取续滤液 10 mL 分装于专用离心管中，于台式真空冷冻离心浓缩仪中挥干溶剂至恒重，–20 ℃保存，备用。给药时现配现用，在离心管中加入 opti-MEM 培养基 1 mL 重溶，超声 30 min 使其溶解至无明显固体颗粒，0.22 µm 微孔滤膜滤过后即得。

　　2.2 甘草抗炎生物效价的测定

　　2.2.1 细胞的获取及培养

　　酒精消毒后，取 C57BL/6 的雌性小鼠后腿骨，将装满 DMEM 培养基的 5mL 注射器注入骨髓，在装有 20 mL DMEM 培养基的离心管中反复吹打骨髓 3 次，吹打过程中保持后腿骨在培养基液面以下，加入 5 µL M-csf，吹匀，将含有细胞的培养基转移至细胞培养皿中，20 ℃恒温二氧化碳培养箱内培养。3 天后，补充适量的 DMEM 培养基和 M-csf，继续培养 2 天。

　　然后，将贴壁的小鼠原代骨髓巨噬细胞(BMDMs)细胞用消化液(Trypsin-EDTA∶EDTA=2∶1)消化 1~2 min 后，更换DMEM 培养基，并制成细胞密度为 1×106 cells/mL 的培养基溶液，吸取 500 µL 的含细胞的培养基于 24孔细胞培养板孔内，于 20 ℃恒温二氧化碳培养箱内培养至细胞贴壁。2.2.2 NLRP3 炎症小体细胞模型的构建 首先，弃去 24 孔细胞培养板孔内的 DMEM 培养基，加入含有 LPS(50 ng·mL–1)的 opti-MEM 培养基，20 ℃恒温二氧化碳培养箱内静置 4 h;然后，设置空白组、模型组及给药组，弃去孔板内的 opti-MEM 培养基，给药组分别加入生药浓度为 0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL–1的药液，空白组及模型组加入等量 opti-MEM 培养基，20 ℃恒温二氧化碳培养箱内与细胞共培养 1 h;最后，模型组及给药组内加入 Nigericin(50 µg·mL–1，DMSO)溶液，空白组加入含有等质量浓度 DMSO 的 opti-MEM 培养基，20 ℃下共培养 30 min，收集细胞上清液及裂解液。

　　2.2.3 关键指标的检测

　　通过蛋白质印迹(Western blot)法对细胞上清液中的 IL-1β、Casepase-1 蛋白及裂解液 NLRP3、pro-IL-1β、pro-Casepase-1、ASC 等蛋白的表达进行检测，并应用 Image J 1.8.0 软件对目的蛋白条带进行灰度值分析。取 BMDMs 上清液及裂解液前处理后，电泳，再经转膜将蛋白条带转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，经过孵育相应的一抗及二抗抗体，显影，在 X 光片上显示蛋白条带。通过 Caspase-Glo®1 Inflammasome Assay 检测试剂盒对细胞上清液中 Casepase-1 的表达量进行检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。通过酶联免疫吸附(ELISA)测定法对细胞上清液中 IL-1β 的表达量进行检测，具体操作按照 IL-1βELISA 检测试剂盒说明书进行。

　　通过 CellTiter-Glo(CTG)发光法检测细胞毒性。取培养至对数生长期的小鼠 BMDM 细胞，分别设置空白孔、对照孔及梯度浓度给药孔(生药浓度为 0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL–1)，孵育 6 h 后，吸取细胞上清液 50 µL 转移至 96 孔白板中，每孔加入 CTG 溶液 50 µL，振荡 1 min，测定各孔发光值，并通过公式(1)计算细胞存活率。细胞存活率 =给药孔发光值−空白孔发光值对照孔发光值−空白孔发光值 ×100% (1)

　　2.2.4 生物效价的标化

　　IL-1β 炎症因子是 NLRP3 炎症小体介导表达的下游关键蛋白，且实验结果相对稳定，故采用 ELISA 测定法检测 IL-1β 的表达量，来表征甘草的生物效价。以 MCC950 为阳性对照化合物，依据《中国药典》2020 年版(四部)[9]【生物检定统计法】项下的“量反应平行线法”对甘草醇提物抑制小鼠 BMDM 细胞分泌 IL-1β 活性的效价值进行标化。定义MCC950 的生物效价为 1000 U·mg–1，将抑制率和相应给药浓度输入效价计算软件 BioCalculate V2.0 得到各个批次甘草抑制小鼠 BMDM 细胞分泌 IL-1β 的效价。

　　2.3 感官参数的数据采集

　　2.3.1 甘草断面直径的测量 10 个批次甘草样品均为类圆形片，若为类椭圆形片，则以其短直径作为断面直径测量结果。为了减小实验误差，每批次样品随机取 3 组，每组 100 个饮片作为测量对象[10]，记录其断面直径 2R。2.3.2 甘草色度的测定 色度常用的评价系统是 CIE 1976 L*a*b*标准色度系统，其中 L*表示明度，a*和b*表示不同的色调方向。L*值越大明度越大，感觉越白;反之越暗。a*表示红绿方向，+a*表示红方向，–a*表示绿方向。b*表示黄蓝方向，+b*表示黄方向，–b*表示蓝方向[11]。采用色彩色差仪对甘草粉末进行色度测量。取适量甘草粉末加入专用容器中，在容器底部平铺成3~5 mm 厚度，校准仪器后，将其放置于测定凹槽内进行色度测量，记录甘草样品的 L*、a*和 b*值。每批次样品重复测定 3 次，取其色度指标的平均值。

　　2.3.3 甘草气味的测定

　　为了使样品在利用电子鼻检测时响应值达到最佳状态，参考文献[12-13]方法对样品进样量、顶空温度及顶空时间进行单因素考察。精密称取甘草粉末 0.2 g，置于 10 mL 顶空瓶中，在顶空温度 40 ℃，顶空时间 120 s 条件下，分别考察进样量为 500、1000、2000、2500 µL 时样品的响应值;精密称取甘草粉末0.2 g，置于 10 mL 顶空瓶中，在顶空时间 120 s，进样量 2500 µL 条件下，分别考察顶空温度为 40、45、50、55 ℃时样品的响应值;精密称取甘草粉末 0.2 g，置于 10 mL 顶空瓶中，在顶空温度 55 ℃，进样量 2500 µL 条件下，分别考察顶空时间为 120、240、360 s 时样品的响应值。

　　取同一批次甘草样品(S7)重复测定 5 次，计算 12 个传感器的 RSD(%)值以考察电子鼻仪器精密度。12 个传感器 LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2 的 RSD 值分别为 1.449%、2.933%、2.211%、0.435%、3.278%、1.356%、1.756%、1.133%、1.343%、0.935%、1.641%、1.536%，RSD 值均小于 4%，说明仪器精密度良好。

　　2.4 数据分析

　　将采集的甘草样品感官数据及等级划分数据导入 Simca 14.1 软件中，进行主成分(PCA)分析，并基于 PCA 分析进行正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析，以增大组间差异，更好地挖掘与甘草抗炎活性相关的关键感官参数。根据 PCA 分析及 OPLS-DA 分析的得分图，判断两等级甘草样品的差异。根据OPLS-DA 分析的 loading 图及 VIP 值确定两者间的差异成分，并通过独立 t 检验分析两者差异成分的统计学差异，验证 OPLS-DA 分析结果。3 结果3.1 甘草提取物对 Nigericin 诱导的小鼠原代骨髓巨噬细胞 NLRP3 炎症小体的影响经过 Western blot 法检测空白组、模型组及给药组 BMDM 细胞上清液及裂解液中各关键蛋白的表达，结果见图 3 A，再通过灰度值分析对关键蛋白 IL-1β、Casepase-1 及其前体蛋白 pro-IL-1β 及 proCasepase-1 的条带进行量化，结果见图 3 B~E，以判断甘草提取物是否产生抑制作用。

　　Lamin B 为细胞裂解液的上样量对照，考马斯蓝(Coomassie)染色为上清液的上样量对照。实验结果显示，与模型组相比，给药组细胞上清液中目的蛋白 IL-1β、Casepase-1 的灰度值明显降低，即其表达量显著减少，并且随着给药浓度的增大，两种蛋白的表达量呈现逐渐减少的趋势，而在裂解液中两蛋白的前体蛋白 proIL-1β 及 pro-Casepase-1 的表达则恰恰相反，说明甘草提取物能够抑制 pro-IL-1β 及 pro-Casepase-1 的剪切，从而抑制 LPS 联合 Nigericin 诱导的小鼠 BMDM 细胞上清液中 IL-1β、Casepase-1 蛋白的表达。通过试剂盒进一步检测 IL-1β 的表达及 Casepase-1 的活性，结果见图 4 A、B，发现甘草提取物对 IL-1β 的表达有抑制作用，并能够抑制 Casepase-1 的活性，且在 0.312 5~2.500 0 mg·mL–1质量浓度范围内呈一定的剂量依赖性;并对甘草提取物的细胞毒性进行了检测，甘草提取物在 2.500 0 mg·mL–1质量浓度时对 BMDM 细胞无毒性作用，故选取 0.312 5~2.500 0 mg·mL–1质量浓度范围内进行药效检测。

　　4 讨论

　　近年来，已经有研究报道了甘草中的活性成分对 NLRP3 炎症小体的影响，并对其作用机制进行了深入研究。Li 等[14]研究发现，异甘草素通过抑制磷酸化核因子-ĸB(p-NF-ĸB)、NLRP3 的蛋白质的分泌，促进 Caspase-1、IL-1β 和消皮素蛋白 N 端(GSDMD-N)的裂解，上调微小核苷酸(miRNA)-27amRNA 表达，并降低脾酪氨酸激酶(SYK)的 mRNA 和蛋白质水平等方式抑制 NLRP3 介导的焦亡。付书彬等[15]报道，甘草查尔酮 A 可通过抑制 Caspase-1 前体的剪切，阻断 Caspase-1 p20 介导的 pro-IL-1β的成熟,抑制 NLRP3 炎症小体介导的免疫炎症反应。Xu[16]等也发现了甘草中的活性成分对 NLRP3 炎症小体的抑制作用。目前，甘草提取物对炎症小体的作用尚无人进行验证，本研究在前人研究的基础上构建了炎症小体细胞模型，确定了在体外甘草提取物对 LPS 诱导的小鼠 BMDM 细胞 NLRP3 炎症小体激活的抑制作用，并通过检测其下游关键蛋白 IL-1β 的表达量建立了不同批次甘草样品的生物效价，为甘草质量评价提供新的方法。自古以来，颜色就在甘草质量评价中占据了重要地位。

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　　《本草经集注》记载：“赤皮断理，…最佳…[17]”《新编中药志》记载：“甘草以皮细紧、色红棕、断面黄白色…为佳。[18]”可见，在古代，甘草以外皮色赤、色红棕，断面色黄白者为佳。随着科技的进步，研究者们利用现代仪器对甘草的颜色进行了更深入的研究。曹光昭[19]等将甘草的止咳药效与其色度值进行相关性分析，初步确定了色度值 b*与其止咳药效的相关性。本研究通过现代机器视觉客观量化了甘草的性状参数，弥补了性状评价方法过于依赖经验的不足之处，大大提高了其客观性，减低了因评价人员不同而导致的质量评价差异，并且经过进一步与其抗炎活性进行整合分析，确定了甘草的色度值 b*与甘草抗炎活性的相关性较强。但是，由于市场上多为乌拉尔甘草，本研究未收集到胀果甘草和光果甘草样品，并且应用样品量较小，可加大样品量以及其他基原甘草样品进行进一步验证。

　　参考文献

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　　作者：王钧楠 1，周永峰 2，3，崔园园 2，巩颖 4，柏兆方 2，朱广伟 5，华国栋 6*，张萍 2*