气质联用结合化学计量学对中国白菊特征挥发性成分的研究

　　摘要：为探究不同产地中国白菊的特征挥发性成分，利用吹扫捕集-气相色谱质谱联用技术(Purge-and-trap-gaschromatography-massspectrometry,P&T-GC-MS)对江苏如东、湖北蒋场、湖北黄潭、河南武涉、北京延庆5个产地的菊花样品的挥发性成分进行检测，利用autoGCMSDataAnal策略及化学计量算法对其特征挥发性成分进行筛选。结果共获得醇、烯、酯、烷烃等多种共有化合物。其中，α-蒎烯、菊油环酮等化合物在如东菊花中含量最高，2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇在延庆菊花中含量最高，桉叶油醇在武涉县菊花中含量最高，Β-倍半水芹烯、β-石竹烯等在蒋场镇菊花中含量最高。另外，基于上述特征化合物的判别模型可对菊花的产地进行精准判别，准确率可达98%以上。本研究筛选的特征挥发性成分可为菊花的产地溯源提供一定的理论基础。

　　关键词：菊花;气相色谱-质谱联用;化学计量学;挥发性成分;风味物质

　　中国白菊为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，是我国常见的一种中药材或茶类饮品，2009年被国家列入“药食同源”物品名单[1]。其性微寒，味苦、甘，归肺、肝经。具有疏风散热、清肝护目、清热解毒之功效。临床上主要用于治疗风热感冒、头晕头痛、目赤肿痛、眼目昏花和疮痈肿毒等[2,3]。现代研究表明，菊花中含有多种活性成分，如挥发油类、黄酮类、多糖类、酚类和氨基酸类等[4,5]，具有抗菌消炎、降血糖、降血脂和增强免疫等作用[6-8]。

　　中医论文投稿刊物：《中草药》适合哪些人发表论文 是由中国药学会和天津药物研究院共同主办的国家级药学科技学术性期刊，月刊，国内外公开发行。

　　其按品种可分为杭白菊、贡菊、滁菊、怀菊、亳菊、祁菊等，主要分布于江苏、浙江、安徽、河南、湖北等地[9,10]。由于菊花独特的风味以及含有丰富的活性物质，其也已被广泛开发成各类商品，如与不同种类的茶进行拼配的菊花茶[11,12]。挥发性化合物是菊花主要的活性成分之一，具有显著的抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤和保护心血管等作用[13-15]，同时也是构成菊花香气的重要成分。国内对菊花的研究主要集中在引种驯化、营养繁殖和高产栽培方面。并且主要关注花型、花色、抗性及产量方面，而忽略了菊花的香气选育，由于对香气的认识和了解不足，导致关于菊花香气研究进度相对比较缓慢。

　　目前，国内外菊花挥发性化合物方面的研究主要采用气相色谱法或气相色谱-质谱联用法[16-19]。陈志星等[20]利用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(solid-phasemicroextractions-gaschromatgraphymassspectrometrometry,SPME-GC-MS)从菊花中共鉴定出51种挥发性成分，包括烯类、酯类、醇类，还有少量酸、杂环类和烷类物质，其中主要成分为单萜类化合物α蒎烯(74.04%)、β-月桂烯(5.24%)、α-松油烯(3.96%)、β-蒎烯(3.44%)和γ-松油烯(2.01%)。肖作兵等[21,22]经过研究发现，菊花精油中特征香气物质主要包括α-蒎烯、桧烯、2-β-蒎烯、β-月桂烯、对伞花烃、罗勒烯、α-萜品油烯、樟脑、异龙脑、松油醇、香芹酮、石竹烯、金合欢烯、大根香叶烯B、桉叶油醇和龙脑。

　　郭宣宣等[23]研究了不同产地杭白菊挥发油成分的差异并表明，杭白菊栽培品种、栽培环境和加工方法的不同，都会使其挥发油成分出现差异。周明瑞等[24]研究发现不同产地野菊花的挥发性成分各不相同，相对含量也不一样。栾川与嵩县同在河南，地理位置毗邻，其所产野菊花有较多的相同成分，但相对含量有很大差异;而不同省份所产野菊花的化学成分种类则悬殊较大，可见产地对成分的影响之大。黄亚非等[25]研究发现广西、广东、湖北野菊花挥发油化学成分种类和含量均有明显的差别，并认为这些差异可能与野菊花的产地、气候、生长环境采集时间以及提取条件有密切的关系。

　　综上所述，菊花的产地不同会导致挥发性物质组成及含量差异。 本研究以江苏省如东县、湖北省黄潭镇、北京市延庆区、河南省武涉县、湖北省蒋场镇五个产区菊花作为研究对象，首次运用吹扫捕集-气相色谱质谱联用技术对不同产地菊花挥发性成分进行分析，并结合化学计量学方法高通量筛选不同产地菊花中的特征挥发性成分，来探究挥发性成分与产地之间的相关性。本文运用具有色谱图提取，峰值提取，峰值注释，时间偏移校正和统计分析等功能的软件对数据进行分析，避免了由于人为分析工作量大且容易遗漏大部分有用化合物信息等问题，为菊花中的特征挥发性化合物的组成以及产地溯源分析提供一定的理论基础。

　　1实验部分

　　1.1主要仪器与试剂

　　ThermoScientificTSQ9000型气相色谱三重四极杆串联质谱联用仪(赛默飞世尔科技公司);AtomxXYZ型自动进样器(美国TeledyneTekmar公司);101-1AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。正己烷(色谱纯，≥98%)、2,3-二甲基吡嗪(98%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);1000mg/LC10-C25正构烷烃溶液(上海安谱实验科技股份有限公司)。

　　菊花样品于2020年10—11月采集自当地的种植户或种植基地，在采样过程中，遵循的采样原则为五点取样法，即在离田块四边4～10步远的地方，随机选择5个点取样;取样范围以每个采样点田块或基地大小为准，每个产地选择3个种植基地，每个基地取3组平行，每组平行取10～15个样本。

　　1.2实验方法

　　1.2.1吹扫捕集仪器方法

　　将准备好的样品放入样品瓶中，加入磁力转子并转移到样品瓶中，将每个样品加热至40℃，以氮气(纯度99.99%)为吹扫气体，吹扫11min。吹扫流速为100mL/min，捕集阱温度为280℃，解吸温度为250℃，解吸时间为2.00min，传输线温度为140℃。

　　1.2.2气相色谱-质谱分析色谱柱为熔融石英毛细管柱DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm);载气为高纯氮气(纯度99.99%)，进样口温度为200℃;程序升温过程如下：初始温度为40℃，保持3min，以3℃/min升温至100℃，保持1min，再以8℃/min升温至240℃，保持5min。离子化方式为电子轰击离子化(EI源);传输线温度为240℃;离子源温度为280℃;溶剂延迟时间为2min;氦气流速为1.000mL/min;分流比为30mL/min;使用全扫描模式进行定性分析;质谱检测范围为30～450m/z。

　　1.2.3标准溶液配置方法取100μL正构烷烃，用正己烷稀释100倍，然后用注射针进行液体进样，用于化合物保留指数计算;取10μL2,3-二甲基吡嗪，用超纯水稀释2000倍，得到最终浓度为0.051mg/L的内标溶液，用于菊花挥发性成分的定量分析。

　　1.2.4菊花样品的处理方法采样获得的菊花鲜样于60℃烘箱中干燥24～48h，干燥后的样本于室温下干燥储存。取1.00g菊花干样于进样瓶中，加入1.00mL内标溶液，用于吹扫捕集-GC-MS分析。

　　1.3数据处理菊花样品的GC-MS数据通过实验室自主开发的autoGCMSDataAnal软件[26]进行解卷积和主要差异性化合物初步筛选。化合物鉴定基于质谱匹配NIST库(2017版)和保留指数(NISTChemistryWebBookSRD69(https://webbook.nist.gov))。SIMCA(Version14.1)软件用于不同产地菊花特征挥发性化合物的精准筛选。IBMSPSSStatistics19软件用于人工神经网络(ArtificialNeuralNetwork，ANN)分析;MATLAB2017a用于偏最小二乘判别分析(PartialLeastSquaresDiscriminantAnalysis，PLSDA);SYSTAT13软件用于线性判别分析(lineardiscriminantanalysis，LDA)。

　　2结果与讨论

　　2.1不同产地菊花挥发性成分的GC-MS分析

　　为了明确不同产地菊花中的主要挥发性成分，5种来自不同产地的药用菊花被采集并按同一方法进行干燥加工，后通过吹扫捕集-气相色谱质谱对其挥发性成分进行检测。结果显示，从5个产地的菊花中检测到多种共有挥发性化学成分，主要包括醇类、烯类、烷类、酯类以及少量杂环类化合物，其中α-蒎烯、桉叶油醇、菊油环酮、β-石竹烯、1-戊烯-3-醇等为主要化合物。实验结果表明5种产地菊花中含量较高的化合物主要为烯类以及醇类物质，该结果与夏延斌等[27]的研究相符。

　　2.25种产地菊花的特征挥发性成分的精准筛选

　　为了进一步研究如东、蒋场、黄潭、武涉以及延庆菊花中特征挥发性化合物，采用autoGCMSDataAnal策略及化学计量算法对其特征挥发性成分进行初步筛选并用PLSDA进行判别分析，不同产地的菊花样本得到较好的聚类，黄潭与武涉以及延庆菊花样本部分重叠，如东与蒋场菊花得到较好的区分。各个化合物的变量投影重要性分析值(VIP)，通常认为，VIP值大于1的变量为差异性化合物，可知5个产地菊花样本的VIP>1的化合物共有23个，其中Var6和Var18的化合物的含量仅为其他成分的千分之一，VIP值也较低(分别为1.05和1.19)，且无法进行准确定性，作为特征性挥发成分意义不大，因此本文着重讨论其他21个化合物，分别为α-蒎烯、2-甲基-5-(1-甲基乙基)-双环[3.1.0]-2-己烯、1-戊烯-3-醇、4-异丙基甲苯等。

　　由结果可知，5个产地的菊花样本特征挥发性化合物主要集中在烯类和醇类中。其中如东县菊花样本中菊油环酮、α-蒎烯、龙脑、4,7,7-三甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮、1,2,4-三甲基苯、2-环己烯-1-醇和(1R,5R)-rel-香芹醇含量显著高于其他产地菊花样本;黄潭镇菊花样本中α蒎烯和2-甲基-5-(1-甲基乙基)-双环[3.1.0]-2-己烯化合物的含量最高，尤其是2-甲基-5-(1-甲基乙基)-双环[3.1.0]-2-己烯，含量是其他产地2至40倍;延庆地区的菊花样本中α-蒎烯、樟脑、β-石竹烯和2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇含量较高，其中β-石竹烯和2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇含量远高于其他产地菊花;武涉县菊花中桉叶油醇、樟脑、4-异丙基甲苯、反式-4-(异丙基)-1-甲基环己-2-烯-1-醇、1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇乙酸酯含量较高，其中桉叶油醇、反式-4-(异丙基)-1-甲基环己-2-烯-1-醇和1-辛烯-3-醇乙酸酯化合物含量显著高于其他菊花样本;蒋场镇福田白菊样本中α-姜黄烯、姜烯、Δ-杜松烯、Β-倍半水芹烯、菖蒲二烯和(Z,E)-α-金合欢烯含量较高，显著区别于其他产地的菊花样本。

　　2.35种产地菊花的化学计量学分析

　　将所得到差异性化合物用于菊花产地判别的可行性研究，通过线性判别分析(LDA)，偏最小二乘判别分析(PLSDA)以及人工神经网络(ANN)等算法等对不同产地菊花进行产地溯源研究。结果表明，3种化学计量学模型均能得到良好的判别效果，线性判别分析中刀切交叉验证准确率达99%，PLSDA和ANN分析结果训练集和预测集的准确率均能达到98%以上，实现了不同产地菊花快速准确的产地溯源。上述结果表明产区环境对菊花挥发性化合物的积累具有显著的影响，使得不同产地菊花形成各自独特的香味。

　　3结论

　　本文以5种不同产地中国白菊为研究对象，利用吹扫捕集-气相色谱三重四极杆串联质谱联用仪分析了菊花中含有的挥发性化合物，结果表明5种产地菊花中均含有醇类、烯类、酯类以及少量杂环类化合物。通过autoGCMSDataAnal策略以及化学计量学手段共筛选并定性定量分析了21种特征挥发性成分，其中烯类和醇类为主要特征成分。其中蒋场菊花中有3种区别于其他产地菊花的特征性化合物，武涉菊花有3种特征性化合物，延庆菊花有3种特征性化合物，黄潭菊花有1种特征性化合物，如东菊花有4种特征性化合物。

　　这些特征性挥发成分如α-蒎烯、β-石竹烯、1-戊烯-3-醇等也是食品中常见的香精，具有不同的香味，赋予了不同产地菊花不同的风味。通过21种差异性化合物与不同产地菊花之间的关联建立智能化判别模型(包括PLSDA、ANN和LDA)，模型准确率可达到98%以上，表明基于特征挥发性化学成分可实现菊花的地理溯源。本研究为不同产地中国白菊挥发性化合物的研究提供了部分特征化合物，并为菊花产地溯源的研究提供了一定的理论基础，但由于本研究所选取的菊花产地及品种较少，普适性一般，因此，还需进一步研究更多产地以及品种的菊花特征挥发性化合物。

　　参考文献：

　　[1]陈明珠.杭白菊中黄酮成分的抗糖尿病活性及其机制研究[D].天津:天津科技大学,2019.

　　[2]刘夏进,李懿,宿树兰,等.药用菊非药用部位的资源化利用现状与展望[J].中草药,2020,15:4075-4081.

　　[3]宋颜君,许利嘉,缪剑华,等.野菊花的研究进展[J].中国现代中药,2020,22(10):171-176;182.

　　[4]周衡朴,任敏霞,管家齐,等.菊花化学成分,药理作用的研究进展及质量标志物预测分析[J].中草药,2019,50(19):4785-4795

　　作者：海城英1，白秀云1，陈亨业1，杨小龙1，杨健2，付海燕*1