草莓叶水提物对UVB致皮肤损伤的保护作用

　　摘要为了评价草莓叶水提物(SLWE)延缓皮肤衰老功效，对SLWE成分、抗氧化活性、抑制非酶糖基化(NEG)能力进行了测定;探讨了SLWE对人包皮成纤维细胞(HFF-1)细胞活率、HFF-1中透明质酸(HA)、人Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、羟脯氨酸(HYP)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量的影响。在中波紫外线(UVB)致HFF-1损伤模型基础上，考察了SLWE对保护组活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、MMP-1和超氧化物歧化酶(SOD)的影响，探讨SLWE对UVB致HFF-1损伤保护机制。结果表明，SLWE富含VC、槲皮素、绿原酸、没食子酸及儿茶素类物质，其中，槲皮素含量12.86mg/L，表儿茶素含量10.13mg/L。SLWE自由基清除能力良好，清除不同自由基能力依次为O2-•>DPPH>ABTS>亚铁离子螯合>•OH;体积分数为1%的SLWE水溶液对NEG的抑制率为87.17%;体积分数大于3%的SLWE水溶液可提高HFF-1中HA、COLI和HYP含量(P<0.05)，体积分数为6%的SLWE水溶液可降低MMP-1含量(P<0.01)，表明SLWE具有提升皮肤含水量，增加胶原含量，抑制胶原降解，实现延缓衰老的功效;SLWE可有效降低因UVB刺激而产生的ROS，体积分数6%的SLWE水溶液可显著降MDA，抑制MMP-1表达，提高SOD活力，说明SLWE有助于缓解氧化应激造成的细胞损伤。

　　关键词草莓叶水提物;UVB;人包皮成纤维细胞;损伤保护;延缓衰老;医药与日化原料

　　成纤维细胞分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分，对维持皮肤正常生理状态具有重要意义。皮肤经紫外线长期或大量照射后，会引发光损伤[1]，UVB刺激皮肤产生过多活性氧(ROS)，激活细胞氧化应激反应，脂质、蛋白质氧化、线粒体及DNA受损、细胞膜通透性改变，成纤维细胞周期停滞和凋亡，进而引起皮肤细胞外基质中的胶原蛋白、弹性蛋白及透明质酸降解，造成组织损伤，加速皮肤老化[1-2]。

　　目前，针对草莓的精深加工主要集中在草莓果实，而草莓叶作为草莓生产过程的副产品，大多采用填埋、焚烧等处理方式，存在环境污染等问题。针对不同叶龄的草莓叶制作的草莓叶保健茶研究发现，其含有大量VC、鞣花酸、可溶性糖、原花青素、槲皮素、儿茶素、游离氨基酸等，尤其是VC，其含量可高达每百克叶片160~170mg[3-4]，具有良好的抗氧化活性及延缓衰老功效。但目前针对草莓叶提取物相关功效评价的研究较少，作用机制不明确。本研究制备了草莓叶水提物(SLWE)，并对其进行成分测定、抗氧化及延缓衰老功效评价，同时探讨SLWE对UVB致成纤维细胞损伤保护机制，为其在延缓皮肤衰老方面的应用提供依据，推动草莓副产品价值的深入挖掘和应用。

　　1实验部分

　　1.1材料、试剂与仪器

　　草莓(Fragaria×ananassa)叶片，北京欣宝莱科技有限公司提供。甲醇、乙腈、乙酸、pH2.5磷酸水溶液(色谱级)，盐酸氨基胍、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖、甲醇、醋酸钠、无水三氯化铁(FeCl3)、七水合硫酸亚铁(FeSO4•7H2O)(以上均为AR)，美国Sigma-Aldrich公司;DMEM高糖培养基、磷酸缓冲盐溶液(PBS)，美国Hyclone公司;青链霉素混合液(100×)、胰酶-EDTA、小牛血清(FBS)(以上均为AR)，美国ThermoFisher公司;CellCountingKit(CCK-8)试剂盒、活性氧(ROS)试剂盒、总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)、透明质酸(HA)试剂盒，碧云天生物技术公司;丙二醛(MDA)检测试剂盒、羟脯氨酸(HYP)试剂盒，南京建成生物研究所;人I型胶原(COLI)酶联免疫检测试剂盒、人基质金属蛋白酶1(MMP-1)试剂盒、人基质金属蛋白酶9(MMP-9)试剂盒，武汉华美生物有限公司;人包皮成纤维细胞(HFF-1)，中国科学院干细胞库;去离子水，自制。

　　Agilent1220InfinityII液相色谱系统，AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱(250mm×4.6mm×5µm)，AgilentZORBAXSB-Aq柱(250mm×4.6mm×5µm)，安捷伦科技(中国)有限公司;InfiniteM200PRO酶标仪，瑞士Tecan公司;IX73研究级荧光倒置显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司;LGJ-18真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司;EB-160C/FC手持式紫外灯，美国Spectroline公司。

　　1.2SLWE制备将新鲜草莓叶置于真空冷冻干燥机中，在真空度100Pa，功率1400W，-60℃条件下，干燥24h，冰上磨粉，过100目筛，得到草莓叶冻干粉。按料液比1:20(g:mL)加入草莓叶冻干粉和去离子水，在常温(20℃)，60Hz条件下超声辅助浸提0.5h后，于8000r/min离心10min，离心处理2次，取黄绿色上清液，即为SLWE，用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤除菌，备用。

　　1.3SLWE成分测定利用高效液相色谱仪对SLWE成分进行测定，主要依据国标或卫生标准中的方法。以VC为例，其测试原理为：以VC标准品和去离子水制备不同质量浓度的VC标准工作液，再对测试样以色谱峰的保留时间定性，通过外标法对其进行定量。按照GB5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》第一法测定VC含量;按照《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》保健食品功效成分及卫生指标检验规范第二部分(十六)测定槲皮素含量;按照GB/T22250—2008《保健食品中绿原酸的测定》测定绿原酸含量;按照GB/T8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》测定没食子酸和儿茶素类含量。

　　1.4SLWE抗氧化活性测定

　　1.4.1还原力测定

　　采用铁离子还原/抗氧化能力(FRAP)法[5]，以0.1mmol/LTrolox为阳性对照，以自制去离子水稀释，测定SLWE(体积分数分别为0.01%、0.1%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%)水溶液的FRAP值。

　　1.4.2自由基清除能力测定

　　以自制去离子水稀释，以VC(质量分数0.1%)水溶液为阳性对照，参照XIE等[6]方法测定SLWE(体积分数分别为0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.0%、100.00%)水溶液的DPPH•清除能力;参照RE等[7]方法测定SLWE(体积分数分别为0.10%、0.25%、1.00%、10.00%、100.00%)水溶液的ABTS•清除能力;采用邻苯三酚自氧化法[5]，测定SLWE(体积分数分别为0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的O2-•清除能力。采用YOU等[8]方法测定SLWE(体积分数分别为0.10%、1.00%、2.50%、10.00%、100.00%)水溶液的•OH清除能力;以EDTA-2Na(质量分数0.01%)水溶液为阳性对照，参考GÜLÇIN[9]方法测定SLWE(体积分数分别为0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的金属离子螯合能力。

　　1.5SLWE抑制非酶糖基化(NEG)能力

　　参考庄秀园[10]的方法，以质量分数为0.1g/L的盐酸氨基胍水溶液为阳性对照，pH7.4PBS为空白对照，样品自身荧光强度为样品本底对照，以激发波长370nm和发射波长440nm检测荧光强度，测定SLWE(体积分数分别为0.1%、0.2%、1.0%、10.0%、100.0%)对NEG的抑制率，按式(1)计算。NEG抑制率/%=[1-(A样品-A样品本底)/A空白]×100(1)1.6SLWE对正常生长HFF-1的影响1.6.1HFF-1细胞培养选择生长状态良好、对数生长期的HFF-1置于DMEM高糖培养基[含10%胎牛血清(体积分数)、100U/mL青霉素钠、100mg/L链霉素]，于37℃、5%CO2(体积分数)、饱和湿度进行培养，每3d更换1次培养基。生长约80%融合时，V〔0.25%(质量分数)胰酶〕:V(EDTA)=1:2培养基，进行HFF-1传代。

　　2结果与讨论

　　2.1SLWE成分测定

　　采用高效液相色谱法对SLWE中的VC、槲皮素、绿原酸、没食子酸及儿茶素类进行鉴定，SLWE富含VC、槲皮素、绿原酸、没食子酸及儿茶素类，槲皮素含量最高，达12.86mg/L，表儿茶素10.13mg/L。研究发现，儿茶素类是草莓叶中的主要抗氧化剂之一[12]，同时草莓叶富含VC[13]、槲皮素[14-15]、没食子酸[16-17]、绿原酸[18]等，均为已知抗氧化剂，说明SLWE具有作为抗氧化剂的可能。

　　2.2SLWE抗氧化活性测定

　　2.2.1还原力测定

　　依据SLWE对Fe3+的还原力评价其抗氧化能力，拟合得到的FeSO4•7H2O回归方程为y=0.3405x+0.0017(R2=0.998)。UVB损伤组HFF-1中MDA和MMP-1含量显著提高，SOD酶活力显著降低，说明UVB对HFF-1有明显损伤作用，同时影响HFF-1清除ROS。与UVB损伤组相比，体积分数为6%的SLWE水溶液可显著降低MDA含量，抑制MMP-1表达，提升SOD活力，并且呈现一定的剂量依赖性，说明SLWE对UVB致HFF-1损伤具有保护作用，同时可显著提高细胞抗氧化能力，缓解氧化应激造成的细胞损伤。

　　医学论文投稿刊物：《环境与职业医学》(月刊)创刊于1984年，创办近20年来，一直被中国职业医学界列为最重要学术期刊之一。2001年由李改为双月刊，2002年正式更名为《环境与职业医学》。该刊载文量约40万以上。省部级以上(包括国际性科研基金项目资助，已先后获奖。

　　3结论

　　SLWE富含槲皮素、表儿茶素、VC等多种具有显著抗氧化性成分，且具有良好的自由基清除能力。体积分数大于0.3%的SLWE水溶液可有效去除细胞中的ROS，同时缓解由外源条件，如光照(UVB)等造成的细胞损伤，提高HA含量，提升皮肤含水量，为皮肤提供有利的组织环境;此外，SLWE具有促进HYP和COLI表达，增加胶原含量，抑制MMP-1表达，减少胶原分解的功效，同时阻止胶原发生糖化反应交联变黄。因此，SLWE具有多角度全方位维持皮肤弹性、结构和含水量，减少皮肤暗淡、松弛和皱纹。SLWE可作为一种良好的抗氧化和延缓衰老功效原料，可应用于食品、保健品、化妆品等相关领域，促进草莓叶“废物利用”，挖掘草莓经济效益。

　　参考文献：

　　[1]DENGY(邓映)，ZHONGJQ(钟建桥).Advancesinskinphotodamageandoxidativestress[J].JournalofClinicalDermatology(临床皮肤科杂志)，2017，46(9)：671-673.

　　[2]YINH(殷花)，LINZN(林忠宁)，ZHUW(朱伟).Mechanismsandpreventionofskinphotoaging[J].JournalofEnvironmentalandOccupationalMedicine(环境与职业医学)，2014，31(7)：565-569.

　　[3]LUOXB(罗学兵)，HELM(贺良明).Nutritionalvalueandhealthfunctionofstrawberry[J].FoodandNutritioninChina(中国食物与营养)，2011，17(4)：74-76.

　　[4]WANGLN(王丽娜)，CHANGLL(常琳琳)，WANGGX(王桂霞)，etal.AnalysisofnutrientcompoundsinStrawberryleavesbeforeandaftertheprocessing.AdvancesinstrawberryresearchIV[M]..Beijing：ChinaAgricuturePress(中国农业出版社)，2015：151-155.

　　作者：董坤1，翟文丽1，王兰青2，何聪芬