牛至油对慢性氨氮胁迫下幼鲤鳃、肝、肾、肠道组织结构的影响

　　摘要：探讨牛至油对慢性氨氮胁迫下幼鲤各器官组织结构的保护作用，为集约化水产养殖条件下确定牛至油合适的添加量提供参考依据。挑选450尾初始体重为(17.020.4)的幼鲤，随机分为组：(对照组，养于正常水体中并饲喂基础饲料);L0、L300、L600、L900、L1200(试验组，养于，4.80.2mg/L氨氮水体中并分别饲喂添加、300、600、00、200mg/kg牛至油的试验饲料)，每组设个重复，每个重复尾鱼，养殖试验为期56。结果表明：添加量为900mg/kg时，牛至油对鳃、肝、肾组织发挥的缓解作用最大;当牛至油添加量达到1200mg/kg时，其缓解氨氮胁迫的作用降低。日粮中牛至油添加量为300、600、900mg/kg可以显著增加肠绒毛高度;当牛至油添加量达到1200mg/kg时，牛至油对于肠绒毛的促生长作用减弱。在试验条件下，日粮中添加900mg/kg的牛至油能够最大程度地缓解由氨氮胁迫造成的幼鲤鳃、肝和肾组织的损伤，并且对于幼鲤肠绒毛的生长具有促进作用。

　　关键词：牛至油;慢性氨氮胁迫;幼鲤;组织结构

　　氨氮是鱼类的主要环境胁迫因子，也是水质监测的重要指标。氨氮在水体中的主要存在形式为离子氨和非离子氨(又称为游离态氨)，二者所占比例与温度、值和溶氧等因素密切相关：水体值越高，水中非离子氨所占比例越大，水温升高或溶氧降低也会使非离子氨含量略有增加，当值达到时，氨氮几乎全以非离子氨的形式存在(王琨，2007)。因非离子氨是不带电荷、半径较小的亲脂性分子，极易通过鳃等途径进入鱼体，其毒性远远大于离子氨(Haywood，1983)。随着水产养殖规模的不断扩大，养殖密度过高、饲养方式粗放、不重视水质监测等问题，使得残饵、排泄物大量堆积在水体中并降解为氨氮，导致养殖水体氨氮浓度过高。

　　相关研究指出，鱼类长期生活在非离子氨浓度大于0.1mg/L的水体时，即可造成鱼类慢性氨氮中毒(乔顺风等，2005)。非离子氨不仅会使鱼类的生长以及新陈代谢出现问题，还会损伤鱼体的重要组织器官(管敏等，2020)，如鳃小片萎缩，变粗、变短;肝细胞出现核偏移、空泡化;肾小管、肾小球萎缩、坏死等，甚至造成其死亡。牛至(OriganumvulgareL.)属于唇形科多年生草本植物，其提取物——牛至油可用作饲料添加剂。

　　牛至油的主要成分是香芹酚和百里香酚(Sabahietal2020)，具有抗菌、杀菌等作用。在饲料中添加牛至油，不但能改善饲料的品质，提高动物的生长性能，而且能够增强动物的免疫功能，预防疾病等。在牛至油替代抗生素和氧化锌对断奶仔猪的影响的研究中(温晓鹿等，2020)，发现牛至油的促生长作用略高于抗生素和氧化锌，且同样能够抑制有害菌对肠道的损伤。

　　郝丹丹等(2017)研究发现，在成年蛋鸡饲料中添加牛至油能够提高蛋鸡生长性能、增强免疫机能以及加强肠道健康。韩庆功等(2016)在牛至油对仔猪生产性能、抗体水平及粪便微生物的影响试验中也有相似的结果。目前关于牛至油应用在氨氮胁迫下水产动物养殖上的研究还比较少。因此，本试验通过饲料中牛至油的添加，探讨牛至油对慢性氨氮胁迫下幼鲤各器官组织结构的保护作用，为集约化水产养殖条件下确定牛至油合适的添加量提供参考依据。

　　1材料与方法

　　1.1试验饲料基础饲料组成及其营养水平(风干基础)见表。主要蛋白源为秘鲁鱼粉(粗蛋白质含量67.00%)、豆粕(粗蛋白质含量44.20%);主要脂肪源为大豆油。在基础饲料中分别添加、300、600、900、1200mg/kg的牛至油，以制备试验饲料。每种饲料原料粉碎后过目筛，按照基础饲料配方精确称量、采用逐级扩大法混匀，制成颗粒饲料，在℃烘干后置于20℃保存备用(郝丹丹等，2017)。牛至油预混料剂(诺必达)(其有效成分为香芹酚百里香酚40:1)购自汇海华贸(上海)实业有限公司(批号：428245)。

　　1.2试验动物及分组试验所用鱼苗购自重庆市荣昌区(105.°E，29.4°N)小罗渔场。购买的鱼苗经3%NaCl溶液消毒，在西南大学水产学院校内养殖基地的水泥池暂养后，挑选大小接近、健康无病，初始体重为(17.020.40)的幼鲤450尾，随机分为六组：(对照组，养于正常水体中并饲喂基础饲料)，L0、L300、L600、L900、L1200(试验组，饲养于氨氮浓度为4.870.21mg/L的水体中)(确定依据见1.3饲养管理)，饲喂牛至油添加量分别为、300、600、00、200mg/kg的试验饲料)，每组设个重复，每个重复25尾鱼，分别养殖于水族缸中。

　　1.3饲养管理

　　氨氮浓度的确定：根据研究报导鲤96非离子氨半致死浓度(LC50)为0.6mg/L(韩庆功等，2016)，基于鲤96hLC50的安全浓度应为.06mg/L，确定本试验非离子氨浓度为0.1mg/L，依照非离子氨和总氨氮浓度的换算公式，设置总氨氮浓度为4.8mg/L，实测值为(.870.21)mg/L。

　　1.4样品采集及分析养殖试验结束，禁食24后，对每个养殖缸的幼鲤进行计数和称重。每缸随机挑选尾幼鲤，使用麻醉剂MS222麻醉后在冰盘上取材，采集鱼体右侧第二鰓弓处鳃丝，解剖实验鱼，取出其肾脏、肝胰脏、肠道组织，经.65NaCl溶液漂洗后，用4%多聚甲醛固定，用于制作石蜡切片。

　　2结果

　　2.1牛至油对慢性氨氮胁迫下幼鲤生长的影响

　　养殖试验进行了56，各组试验鱼未见死亡情况，成活率均为100.00%。饲料中添加不同含量的牛至油在慢性氨氮胁迫下对幼鲤生长性能的影响见表。在慢性氨氮胁迫下，未添加牛至油的L0组幼鲤的终末体重、增重率和特定生长率均显著低于无氨氮胁迫的对照组(<0.05l600l300l600l900>0.05)，但均显著高于L0组(<0.05)，L600组的增重率显著高于L1200组(<0.05l300l600l900>0.05)。

　　2.牛至油对慢性氨氮胁迫下幼鲤鳃组织的影响

　　牛至油对氨氮胁迫下幼鲤鳃、肝、肾和肠道组织显微结构的影响，氨氮胁迫下的L0组幼鲤鳃小片长度显著小于无氨氮胁迫的对照组(<0.05)，鳃小片宽度则相反(<0.05)。在氨氮胁迫的各组中，当牛至油添加量从增加00mg/kg时，鳃小片长度呈增加趋势，鳃小片宽度呈降低趋势;L300、L600和L900的鳃小片长度显著高于L0组(<0.05)，低于组(<0.05)，这组之间差异不显著(0.05)，其中以L900鳃小片长度最长，(150.0813.37)μm;L300、L600和L900的鳃小片宽度显著低于L0组(<0.05)，除L900组外，均显著高于组;300和600之间鳃小片宽度差异不显著(0.05)。当牛至油添加量继续增加到200mg/kg时，鳃小片长度显著降低(<0.05)，鳃小片宽度显著增大(<0.05)。从以上结果来看，L900的鳃小片长度和鳃小片宽度最接近于无氨氮胁迫的对照组。

　　3讨论

　　3.1氨氮胁迫对幼鲤鳃、肝、肾和肠道的影响

　　水体氨氮的增高会对鱼类产生急性毒性和慢性毒性效应。急性效应表现为鳃过度通气、机体亢奋、游泳不稳定、失去平衡、反应迟缓、抽搐或死亡，体色变化，免疫防御功能受到抑制，病原敏感性增加等(Ipetal,2001;Silvaetal2018;孟振等，2020;卢霞等，2018)。

　　在白斑狗鱼(Esoxlucius)、拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)和团头鲂(Megalobramaamblycephal)的急性氨氮胁迫试验中发现，动物的死亡率与氨氮浓度、持续时间相关(彭军辉等;2018;张武肖等，2015)。而慢性毒性效应则表现为摄食降低、生长减慢、免疫力降低等(Pengetal,2017)。本试验对幼鲤进行慢性氨氮胁迫毒性试验时，幼鲤成活率为100.00%，而终末体重、增重率和特定生长率都显著低于正常养殖条件，与上述试验结果相似。愈来愈多的研究者认为，鱼类氨中毒致死可能与机体氧化损伤和免疫抑制有关。

　　鱼类处于氨氮胁迫中，机体内源性氨的排泄被阻断，外源性氨经鳃和皮肤进入体内，产生大量氧自由基。当鱼类的抗氧化酶体系不能完全清除这些自由基时，自由基的过度积累会破坏组织结构，加剧膜脂质过氧化程度及醛酮类物质积累，醛酮类又使抗氧化酶活性失活，进一步加重组织损伤。随着外源性氨逐渐释放到血液中，影响淋巴细胞和巨噬细胞的含量和活性，使得免疫反应受到抑制(林小能，2013)，各个组织器官更易遭受自由基的攻击而损伤。鳃不仅是鱼类重要的呼吸器官还具有调节渗透压、过滤食物、排泄氨氮等功能。

　　鳃直接暴露于外部环境，参与水环境与鱼体之间的物质交换，因此鳃组织最易受到不良环境的影响。在团头魴、圆斑星鲽(Veraspervariegatus)、淇河鲫(Carassiusauratus)、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)和虎斑乌贼(Sepiapharaonis)的急性氨氮胁迫试验表明，随胁迫时间的延长和氨氮浓度的增加，鳃组织出现不同程度的损伤，表现为鳃丝毛细血管扩张、水肿，表面分泌物增多，鳃小片卷曲、融合、变短，上皮组织增生，上皮细胞核溶解，细胞空泡化，呼吸上皮细胞排列紊乱、水肿变性、坏死、脱落，柱状细胞排列不整齐等(张武肖等，2015;吴利敏等，2020;郝小凤等，2012;陈思涵等，2018)。这些与本试验研究结果情况相似。本试验中，慢性氨氮胁迫导致幼鲤鳃组织增生，鳃小片变粗、变短，扁平上皮细胞排列混乱、脱落。

　　王梦杰等(2021)亦报道慢性氨氮胁迫后，台湾泥鳅随氨氮浓度的升高出现不同程度的鳃组织损伤，表现为鳃小片短小、上皮细胞水肿、细胞空泡化、上皮细胞坏死和脱落。这主要是由于水体中的非离子氨为亲脂性分子，半径较小，容易穿透脂质性生物膜的疏水性微孔进入生物体内，从而损害鳃组织，导致机体出现缺氧、酸碱平衡失调、渗透压平衡被破坏以及氨代谢受阻等一系列生理损伤，进而导致其免疫能力受到损害，乃至死亡(吴利敏等，2020;Dutraetal，2017)。

　　肝脏是机体主要的代谢和解毒器官，氨氮经血液运输到肝脏后，肝脏利用其丰富的酶降低氨氮毒性。高浓度的非离子氨作用于肝脏，导致肝功能障碍，体内抗氧化、抗应激能力下降，过氧化物在肝脏中累积，进一步加重毒性反应。在虎斑乌贼、圆斑星鲽、团头魴、中华条颈龟(M.sinensis)、线纹海马Hippocampuserectus的急性氨氮胁迫试验中，肝脏出现肝小叶轮廓模糊不完整、排列不紧密，肝血窦扩张、缩小、充血、消失;肝细胞肿胀、轮廓模糊，胞浆疏松透明，变性、空泡化、溶解，肝细胞核出现肿大、偏移、溶解、消失等现象(陈思涵等，2018;张武肖等，2015;黄祖彬等，2021;罗辉玉等，2020)。

　　本试验中，慢性氨氮胁迫导致幼鲤肝细胞轮廓模糊不清，肝血窦中红细胞核浓缩度低，导致载氧能力下降。管敏等(2019)亦证实慢性氨氮胁迫能降低子二代中华鲟(Acipensersinensis)肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(TAOC)、谷胱甘肽GSH)含量、溶菌酶LZM)活性及免疫球蛋白IgM)，使机体抗氧化能力和免疫能力减弱。除此之外，本试验亦监测到各氨氮胁迫组的肝细胞直径显著小于生活在正常水体中的幼鲤的肝细胞直径，这可能是由于氨氮胁迫影响肝功能，从而造成肝细胞变小。

　　中华鲟、史氏鲟(Acipenserschrencki)幼鱼肝体比随着水体氨氮浓度的升高呈逐渐降低趋势，亦证实了这一点(管敏等，2019;2020)。然而，黎庆等(2015)报道慢性氨氮胁迫组黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)幼鱼的肝体比显著高于对照组，认为是醛酮类物质过度积累诱发了肝脏器官组织水肿。肝脏对氨氮胁迫表现出来的不同反应可能与鱼种、氨氮浓度及氨氮胁迫时间等因素有关，需要进一步研究分析。肾脏作为鱼类的主要排泄器官，在清除机体代谢废物，调节水盐平衡、渗透压平衡等过程中发挥重要的作用。水体中过多的有害物质会对鱼类肾脏的组织结构及其生理功能产生较大的危害。

　　张武肖等(2015)和吴利敏等(2020)研究表明，急性氨氮胁迫对团头鲂(Megalobramaamblycephala)、淇河鲫肾脏的危害主要表现为肾小管管腔缩小、肾小球萎缩，肾小囊腔膨大、淋巴细胞浸润等，且随着时间的延长和浓度的增加出现肾小管坏死、肾小球坏死的现象。急性氨氮胁迫使得中华条颈龟肾脏肾小管管腔缩小，上皮细胞发生颗粒变性，部分细胞从基膜脱落，细胞膜破裂，肾小球体积增大、毛细血管网扩张，细胞核固缩甚至溶解消失，间质炎性细胞浸润等(黄祖彬等，2021)。

　　本试验中，慢性氨氮胁迫下的组幼鲤肾小管管腔缩小，有的甚至坏死，肾小球萎缩，肾小囊腔宽度增加，与上述试验结果相似。这与机体抗氧化能力和免疫力的降低不无关系。姜会民(2012)研究发现高浓度氨氮胁迫使得黄河鲤鱼(Cyprinuscarpio)肾脏超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性下降和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量增加，反应了氨氮胁迫对肾脏造成了损伤，使得其抗氧化能力下降。

　　戚晓舟(2017)研究表明，高浓度氨氮胁迫或长时间低浓度氨氮胁迫鲫鱼，其肾脏抗氧化基因(GST、CAT、PRX)和免疫相关基因(ILβ、TNFα和CXCL)的表达量低于对照组。关于氨氮胁迫对鱼类肠道组织结构影响的报道较少。王琨等(007)表明非离子氨浓度大于0.137mg/L时，幼鲤肠道上皮细胞出现变性、坏死、脱落的情况，与本研究出现的情况相似。在本研究中，慢性氨氮胁迫导致幼鲤肠黏膜上皮细胞部分脱落，肠绒毛受损，但并未对肠绒毛高度和肌层厚度产生显著影响。这可能与氨氮破坏肠道免疫防御系统有关。

　　熊大林等(2020)研究急性氨氮胁迫对凡纳滨对虾Litopenaeusvannamei的影响，发现肠道免疫指标如酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、溶菌酶(LZM)、酚氧化酶原(proPO)以及抗氧化功能指标如总抗氧化能力(AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、热休克蛋白70(HSP70、热休克蛋白90(HSP90)等均随胁迫时间的延长呈先升后降的趋势。戚晓舟(2017)报道氨氮胁迫会影响鲫鱼肠道菌群结构组成，引起肠道菌群结构失衡，从而危害肠道健康。

　　3.2牛至油对氨氮胁迫下鳃、肝、肾和肠道的缓解作用

　　牛至油的主要成分是香芹酚和百里香酚，能够清除自由基，螯合过渡金属离子，分解过氧化产物(Zhangetal，2021)，缓解机体氨氮胁迫受到的损伤。研究表明，饲料中添加适量的牛至油能增加幼鲤、斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、虹鳟(Oncorhyncusmykiss)、锦鲤、斑马鱼(Brachydanioreriovar)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)肝脏、血液SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)、髓过氧化物酶(MPO)活性和一氧化氮(NO)含量，降低MDA含量(AbdelLatifetal，2020;Zheng，2009;ileretal，2017;Zhangetal，202;ashidianetal，2021;spiritoantoetal，2019;)。

　　机体抗氧化能力的升高有助于清除体内过多的过氧化产物及自由基，降低其对各组织器官的损伤。本试验中，当牛至油添加量从300mg/kg增加到900mg/kg时，鳃小片卷曲和变粗、变短的程度逐渐减轻，扁平上皮细胞排列逐渐规则，脱落的现象减少;肝细胞空泡化的程度逐渐减轻且出现核偏移的细胞数量逐渐减少;肾小管和肾小囊的损伤减轻，肾小囊腔宽度和肾小球长径与无氨氮胁迫的对照组相似。这说明适量的添加牛至油有利于缓解慢性氨氮对鳃、肝和肾组织的胁迫。

　　除抗氧化作用外，牛至油增强免疫力的作用亦为其缓解氨氮胁迫起到至关重要的作用。给鲤、锦鲤、斑马鱼、尼罗罗非鱼、虹鳟和斑点叉尾鮰饲喂含适量牛至油的饲料后，血清吞噬活力、吞噬指数、溶菌酶活性、补体、IgM显著升高(AbdelLatifetal，2020;Zhangetal2020;ashidianetal，2021;spiritoantoetal，2019;Dileretal，2017;Zheng，2009)，其感染嗜水气单胞菌、格氏乳球菌、无乳链球菌后的死亡率显著降低。

　　免疫力的增强有助于损伤组织的修复。Ran等(2016)给杂交罗非鱼(O.niloticus♀×O.aureus♂)饲喂含香芹酚和百里香酚混合物(1:1)的饲料，其头肾巨噬细胞、吞噬活力和血浆溶菌酶活力均增强。牛至油中的百里香酚有抗炎作用，能够抑制鼠乳腺上皮细胞TNFα和IL的表达(Kuetal，2013)，减少IL的分泌及改善鼠脾细胞IL10/IL的比值(Wlodarskaetal，2015)。

　　香芹酚通过抑制环氧合酶(COX)和环氧合酶(COX)起到抗炎作用(Bimczoketal，2008)。Wlodarska等(2015)表明香芹酚处理显著上调鼠结肠干扰素γ(IFNγ)的表达水平。hang等(2020)给锦鲤饲喂周含牛至油的饲料后，其肠道肿瘤坏死因子α(TNFα)、转化生长因子β(TGFβ)表达下调。在嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)感染鲤的试验中，AbdelLatif等(2020)认为脾脏和头肾正常组织形态的维持与牛至油上调肝脏炎症因子白细胞介素β和白细胞介素10(IL1β和IL10)的表达有关。

　　综上所述，饲料中添加适量的牛至油，在一定程度上能够缓解慢性氨氮胁迫对幼鲤的鳃、肝、肾以及肠道组织的损伤。对于鳃、肝、肾组织来说，添加量为00mgkg时，牛至油对氨氮胁迫的缓解效果最佳，当牛至油添加量达到200mgkg时，牛至油对慢性氨氮胁迫损伤的缓解作用降低;针对肠道组织而言，牛至油添加量为00、00、00、200mgkg时均可以减轻氨氮胁迫对幼鲤肠道组织的损伤。饲料中添加适量牛至油有利于肠绒毛的生长，促进幼鲤肠道的发育，提高肠道消化吸收的能力，当牛至油添加量达到200mgkg时，牛至油对肠绒毛的促进作用有所减弱。

　　参考文献

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　　韩庆功宋云义崔艳红等2016.牛至油对仔猪生产性能、抗体水平及粪便微生物的影响[J].河南农业科学45()：113117.

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　　作者：孟骞骞，张雨晴1,，谭智敏，周针宇，田佳明，谢开英，李萍，沈水宝，王文娟