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三种细菌对茅苍术的生长、药效成分及关键酶基因的影响

时间:2021年05月20日 分类:农业论文 次数:

摘要为了培育优质茅苍术种质资源,提高茅苍术药材品质,本研究以茅苍术植株为材料,通过接种枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、胶质芽孢杆菌Bacillusmucilaginosus以及细黄链霉菌Streptomycesmicroflavus的方法,考察不同菌株对其生长特性、主要药效成分积累及

  摘要为了培育优质茅苍术种质资源,提高茅苍术药材品质,本研究以茅苍术植株为材料,通过接种枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、胶质芽孢杆菌Bacillusmucilaginosus以及细黄链霉菌Streptomycesmicroflavus的方法,考察不同菌株对其生长特性、主要药效成分积累及其关键酶基因表达的影响。结果发现接种种菌株均在不同程度促进了茅苍术的生长,过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性和叶绿素含量,以接种胶质芽孢杆菌组对苍术苗的作用最明显,这组的株高、茎粗、根长、根鲜质量及根干质量较对照组分别增长了23.0%、28.9%、24.2%、34.8%和39.0%,抗氧化酶活性和叶绿素含量与对照组的差异也达到显著水平;接种胶质芽孢杆菌组羟基甲基戊二酸单酰辅酶还原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶(FPPS)和乙酰辅酶羧化酶(ACC)基因的相对表达量均显著增加,而另两组只有HMGR和ACC相对表达量明显增加。这表明不同的菌株对茅苍术的促生作用不一,我们的研究结果为人工调控茅苍术的栽培生产实践提供科学依据。

  关键词茅苍术;细菌接种;抗氧化酶;药效成分;关键酶基因

茅苍术培育

  茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.)DC.)为菊科Asteraceae苍术属AtractylodesDC.)多年生草本植物,其干燥根茎入药即为“苍术”蒋玲等,2017)。茅苍术中主要包含苍术酮、β桉叶醇等倍半萜类成分,还有苍术素等聚乙炔类成分徐晓兰等,2007)。茅苍术作为江苏省著名道地药材,近年来由于对其野生资源的掠夺和生态环境的破坏,还有其自身原因,茅苍术野生资源已濒临灭绝欧阳丽敏等,2020)。

  虽然目前通过人工栽培在一定程度上可以解决茅苍术资源短缺的问题,但仍然存在活性成分含量低于原产区的问题陈飘雪等,2020),如何提高栽培地区茅苍术品质是目前重要的研究方向之一。植物主要通过甲羟戊酸(mevalonatepathway,MVA)途径合成倍半萜类成分,而有两个酶在此途中起重要作用(Qianetal.,2017)。其一为羟基甲基戊二酸单酰辅酶还原酶(3hydroxymethylglutaryl coenzymeA,HMGR),HMGR主要催化MVA的生成(Bhambhanietal.,2017)。

  其二为法呢基焦磷酸合酶(farnesylpyrophosphatesynthase,FPPS),FPPS催化生成倍半萜类化合物的前体法呢基二磷酸(farnesyldiphosphate,FPP)。苍术素属于聚炔类成分,而聚炔类化合物的生物合成与脂肪酸类似陶金华等,2014),其中乙酰辅酶羧化酶(acetylcoenzymeAcarboxylase,ACC)是脂肪酸及聚炔类化合物生物合成途径中的关键酶。ACC的表达容易受到外界因子的影响,如真菌诱导子可使ACC的表达显著增强FigueroaBalderasetal.,2017)。植物根际存在大量微生物,它们作为土壤生态系统中物质循环和能量流动的主要推动者,可以很大程度促进药用植物的生长,提升药用植物的品质。

  近年来,关于药用植物微生物互作的研究越来越多,也有越来越多的学者开始尝试用微生物促进开发植物资源。而微生物可以直接或间接作用于植物,对于调控药用植物生长、影响其适应环境的能力、提高其有效成分的含量等方面都有重要的作用彭政等,2020)。已有学者在这方面对茅苍术进行了研究,梁雪飞等(2018)在温室条件下研究三种丛枝菌根真菌对茅苍术的生长发育与药效成分积累的影响,筛选出G.mosseaeBGCAM0045可作为茅苍术苗菌根化处理的优良菌株。陈飘雪等(2020)将内生菌复合接种于茅苍术,探究其对于茅苍术生长和倍半萜积累的影响。

  但尚未有学者从土壤细菌的角度研究其对茅苍术的促生作用。本研究选择土壤中的有益菌株:枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、胶质芽孢杆菌Bacillusmucilaginosus以及细黄链霉菌Streptomycesmicroflavus作为供试菌株进行研究。枯草芽孢杆菌是植物根际促生细菌(PGPR)的主要菌类之一,其会产生各类代谢物质,促进植物生长发育,增强植株抗性继而抵抗病虫害李怡洁和杨佐忠,2019)。研究发现枯草芽孢杆菌能提高党参的发芽、根长、分枝等生长指标(Wuetal.,2016)。

  胶质芽孢杆菌是一类能分解土壤和硅酸盐矿物的化能异养型好氧菌,土壤中难以利用的钾、磷元素都可以被此菌变为有效钾、磷,以促进植物的生长发育田稼等,2017)。细黄链霉菌为链霉菌属,不仅能增强植物抗病性,还能促进植物生长发育,提高作物产量李堆淑和冀玉良,2018)。本研究选取三种有益菌株接种于茅苍术种苗,旨在模拟茅苍术的原生境,探索其对茅苍术的生长特性、主要药效成分的变化以及HMGR,FPPS,ACC等关键酶基因的表达,考察不同菌株对茅苍术的促生作用以及对药效成分积累的影响,为人工调控茅苍术的栽培生产实践提供科学依据。

  1结果与分析

  1.1不同菌株对茅苍术种苗生长的影响

  与对照组相比,Bacillussubtilis处理组(A1)、Bacillusmucilaginosus处理组(A2)的株高、茎粗、根长均有显著提高(P<0.05)。而Streptomycesmicroflavusvar.Lactosus处理组(A3)的各项生长指标则没有显著性的提高。A2处理组的株高、茎粗、根长、根鲜质量及根干质量较对照组分别增长了23.0%、28.9、24.2%、34.8%和39.0%,其根冠比也有显著性提高。茅苍术种苗的生长在接种种菌株后均得到了促进,其中,A2处理组效果最佳,其次为A1和A3处理组表。

  1.2不同菌株对茅苍术种苗抗氧化酶活性的影响

  实验处理0d时,各处理组之间抗氧化酶系活性几乎没有差异。在接种三种菌株后,茅苍术的SOD、CAT、POD酶活性均有提高 。而A1、A2处理组对三个酶活性均影响较为显著,其中SOD酶活性峰值分别为同期对照组水平的118%和137%,SOD酶活性分别在14d(A1)、14d(A2)和21A3)达到峰值;CAT酶活性的峰值分别为同期对照组水平的154%和148%,CAT酶活性分别在7d(A1)、14d(A2)和14d(A3)达到峰值;POD酶活性峰值则分别为同期对照组水平的106.8%和108.5%,POD酶活性均在14d达到峰值。与此同时,A3处理组的影响并不显著。结果表明,接种种细菌均能影响茅苍术幼苗的抗氧化酶系的活性,其中A2处理组的影响最为明显。

  2讨论

  本实验共测定了种供试菌株对茅苍术生长特性的影响,其中枯草芽孢杆菌以及胶冻样类芽孢杆菌为根际促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR),它们是天然存在于土壤并定殖于植物根际的微生物,不仅能改善土壤理化性质,还可以促进植物生长、增强植物抗逆性等郭凤仙等,2017)。

  这两个处理组的茅苍术的生长发育均得到了促进,可能是因为PGPR通过包括固氮、溶磷、解钾、溶铁、分泌植物激素及相关调控物质和释放挥发性物质等机理促生孙韵雅等,2020)。而第三种细黄链霉菌是链霉菌属放线菌,它也促进了茅苍术的生长发育,可能是其通过作为菌肥,转化土壤中氮磷元素提高土壤肥力,刺激茅苍术生长谭之磊等,2008)。正常生长条件下,植物体内抗氧化酶系保持一定的活性,共同协作下清除多余的ROS(王玉卓等,2020)。

  SOD、CAT、POD作为抗氧化酶系中的主要酶类,在正常及逆境情况下,活性会升高,及时清除植物体内活性氧,提高植物的抗逆性班甜甜等,2018)。而之前也有文献报道,接种丛枝菌根真菌会对茅苍术的生理活性产生显著的影响梁雪飞等,2018)。本实验在接种三种菌株后,发现茅苍术的SOD、CAT、POD酶活性均有提高,其中A2处理组的影响最为明显,其SOD、CAT、POD酶活性分别为同期对照组水平的137%、154%和108.5%,表明接种供试菌株可以调节抗氧化酶活性,在一定程度上提高茅苍术的生理代谢能力和应对胁迫能力。

  叶绿素含量是判断植物光合作用强弱的指针,植物叶片衰老时叶绿素占比呈下降趋势,而IAA、CTK则可以抑制与延缓植株叶片的衰老,使叶绿素始终占比较高。接种促生菌可以提高宿主植株吲哚乙酸及赤霉素质量分数进而提高叶绿素含量丁新景等,2016)。本研究的结果表明,三种供试菌株均提高了茅苍术的叶绿素总量,其中A1、A2处理组提高较显著,可能是通过提高茅苍术吲哚乙酸及赤霉素质量分数进而增加叶绿素含量,提高植物光合效率,促进植物生长。HMGR被认为是MVA途径上的第一个限速酶,其表达量的多少决定着许多有效药用活性成分产量的多少(Vranováetal.,2013)。

  本实验中,尽管各处理组接种不同菌株后,对两个关键酶基因相对表达量影响各不相同,但各组HMGR关键酶基因相对表达量都上调,其β桉叶醇和苍术酮含量也上升了。而FPPS作为MVA途径中另一个重要酶,其表达量的多少也显著影响了倍半萜类成分的生物合成(Guoetal.,2014)。

  各处理组的β桉叶醇和苍术酮含量变化趋势与FPPS表达量变化趋势基本一致,A1与A3处理组FPPS相对表达量基本持平,没有显著性差异,A2处理组FPPS相对表达量显著增加,A2处理组的β桉叶醇和苍术酮含量显著高于另外两组,说明关键酶基因HMGR、FPPS表达量与β桉叶醇和苍术酮的含量紧密相关陆奇杰等,2019)。ACC作为聚炔类成分生物合成路径上的关键酶,其相对表达量的变化趋势与苍术素基本一致,说明ACC表达量与苍术素的含量紧密相关。

  苍术素、苍术酮和β⁃桉叶醇是茅苍术的主要药效成分,常被作为茅苍术的质量评价指标。β⁃桉叶醇为苍术倍半萜类代表成分,具有调节胃肠运动、抗胃溃疡、降血糖、保护肝脏和抗菌等作用吴佳新,2016,江苏农业科学,44(3):2830)。而接种三种供试菌株提高了茅苍术中种主要药效成分的含量,尤其是A2处理组,不仅对β⁃桉叶醇的积累有明显促进作用,其对三种成分均具有明显的促进积累的作用,极大地提高了茅苍术的品质。

  本研究选择了三组供试菌株将其接种于茅苍术幼苗,通过分析茅苍术幼苗的生长特性、主要药效成分积累和关键酶基因表达的影响来分析这三种菌株的效果。结果表明,不同的菌株对茅苍术的促生作用不一,A2处理组的Bacillusmucilaginosus菌株对于促进茅苍术的生长发育,提高茅苍术的品质具有显著的影响。本研究期望为茅苍术优质资源的开发和可持续性利用使用菌剂提供应用基础,为人工调控茅苍术的栽培生产实践提供研究依据。

  生态学评职知识:生态学论文审稿时间长不长

  3材料与方法

  3.1实验材料

  供试茅苍术:本实验于2020年月20日将收集的茅苍术种苗来自江苏茅山地区种植于南京中医药大学药用植物园人工气候室中,经南京中医药大学中药资源与开发教研室谷巍教授鉴定为菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.)DC.的根茎。

  对药效成分含量进行测定。对照品溶液的制备:精密称取苍术素、苍术酮和β桉叶醇的对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇制成质量浓度分别为0.149、0.150、0.150mg/mL的混合对照品溶液。供试品溶液的制备:精密称取不同组别茅苍术根茎粉末2.00,置棕色具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞称定质量,超声0min,放冷,加甲醇补足,摇匀滤过,取续滤液过0.45μm微孔滤膜后得供试品溶液。

  色谱条件:色谱柱:AgilentHCC18Analytical色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相:乙腈0.1%甲酸水溶液,采取梯度洗脱:0~5min,A5%;5~6.25min,A10%~14%;6.25~26.25min,A14%~30%;26.25~32.5min,A30%~52%;32.5~42.5min,A52%~60%;42.5~73.75min,60%~75%;73.75~80min,A75%~80%;80~92.5min,A80%~10%,检测波长:苍术素340nm;苍术酮220nm;β桉叶醇203nm,流速0.8mL/min,柱温30°C,乙腈、甲酸均为色谱纯。

  样品测定:取对照品溶液适量,测定对照品苍术素、苍术酮、β桉叶醇的峰面积,以对照品浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),得到标准曲线。取10mL供试品溶液注入高效液相色谱仪中检测,并按照标准曲线计算得到相应成分的含量。

  参考文献:

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  作者:裴凌峰谷宇琛谷巍1,2*张松保马丽杰郭彦芳陈子匀张阿琴

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