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天然酚类化合物与两种化学杀菌剂的联合抑菌活性研究

时间:2021年05月13日 分类:农业论文 次数:

摘要:为探索天然酚类化合物百里香酚、和厚朴酚与化学合成杀菌剂百菌清、啶酰菌胺混配的增效作用,筛选出能够防治灰霉病的混剂,本研究将百里香酚、和厚朴酚分别与百菌清、啶酰菌胺以不同比例混配,采用菌丝生长速率法测定其对灰葡萄孢菌Botrytiscinerea的抑

  摘要:为探索天然酚类化合物百里香酚、和厚朴酚与化学合成杀菌剂百菌清、啶酰菌胺混配的增效作用,筛选出能够防治灰霉病的混剂,本研究将百里香酚、和厚朴酚分别与百菌清、啶酰菌胺以不同比例混配,采用菌丝生长速率法测定其对灰葡萄孢菌Botrytiscinerea的抑菌活性,并将Bliss法、Mansour法和孙云沛法结合,以优化筛选方案,评价混剂的联合毒力。实验结果表明:将Bliss法、Mansour法和孙云沛法结合使用能够有效降低筛选工作量,且准确率较高;百里香酚和百菌清以质量比5:1、2:3、1:5和1:10比例混配,和厚朴酚和百菌清以质量比10:1、5:1、3:2、2:3和1:10比例混配均表现出协同增效作用;和厚朴酚和百菌清以10:1比例混配时协同增效作用最明显,其CTC值为309.15,以1:10比例混配时抑菌活性最高,其对B.cinerea的EC50为0.29mg/L,高于杀菌剂百菌清。因此,将定性分析方法与定量分析方法结合使用是筛选杀菌剂混剂配方的合理方案,天然酚类化合物百里香酚、和厚朴酚与百菌清以合理比例混配所得混剂具有防治灰霉病的潜力。

  关键词:天然酚类化合物;百里香酚;和厚朴酚;合成杀菌剂;协同作用;灰葡萄孢菌

化合物

  0引言

  灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)是主要的植物病原真菌之一,其寄主广泛,能够引起多种蔬菜、果树、花卉等作物的灰霉病[1]。灰霉病危害严重,且易于传播,若未及时防治常会造成严重的经济损失[2]。在现阶段的农业生产模式中,灰霉病的防治仍依赖化学农药的使用[3],生物防治等措施因其自身的局限性,尚未大范围应用[4]。在生产中,防治灰霉病的常用药剂根据作用方式可分为保护性杀菌剂和内吸性杀菌剂。

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  啶酰菌胺(boscalid)是防治灰霉病最为常用的内吸性杀菌剂,属于烟酰胺类化合物,其作用机制独特,能够抑制植物病原真菌线粒体的琥珀酸脱氢酶,阻断三羧酸循环,从而抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发[5]。啶酰菌胺具有高效、低毒的特点,对番茄、黄瓜、草莓等多种作物灰霉病防效显著[6-8]。但与多数内吸性杀菌剂相同,其作用位点单一,属于高抗性风险的杀菌剂[9]。目前,B.cinerea对包含啶酰菌胺在内的多种内吸性杀菌剂已处于较高抗性风险水平,亟需寻找合理的方案来延缓抗药性的蔓延[10]。另外,啶酰菌胺等琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂(SDHIs)对鱼类具有毒性,其大量使用存在环境污染风险[11-13]。百菌清(chlorothalonil)是灰霉病防治中最为常用的保护性杀菌剂之一。

  保护性杀菌剂不易产生抗药性,但抑菌活性低于内吸性杀菌剂[14],需进一步提高其抑菌活性。混剂的开发和利用是延缓抗药性发生的重要手段,合理搭配的混剂不仅能够提高抑菌活性,降低农药使用量和防治成本,且能够延缓抗药性的发生。植物在长期进化过程中,为抵抗病原菌的侵入,产生了很多具有抑菌活性的次生代谢产物。这些次生代谢产物是筛选杀菌剂抑菌活性成分的宝库,天然杀菌剂活性成分筛选在新型杀菌剂的研发中占有重要地位[15]。

  但是,大多数次生代谢产物的抑菌活性低于化学合成的杀菌剂,难以将其直接用于植物病害防治。除直接利用外,与化学合成杀菌剂混配使用也是从天然产物研发新农药的途径之一。作者所在课题组在前期研究中发现:天然单萜酚类化合物与噻呋酰胺和苯醚甲环唑之间具有明显的协同增效作用,部分混剂配方对立枯丝核菌的抑菌活性优于化学合成杀菌剂噻呋酰胺和苯醚甲环唑[16]。将作用机制独特的天然抑菌活性成分与化学合成杀菌剂混配,不仅有望获得高活性的抑菌组合物,而且能够降低化学农药使用量,是开发新型杀菌剂混剂的合理策略。

  本课题组在筛选天然抑菌活性成分的过程中发现:天然酚类化合物百里香酚、和厚朴酚对B.cinerea具有一定的抑制活性,但低于化学合成杀菌剂百菌清和啶酰菌胺[17]。因此,本研究将百里香酚、和厚朴酚分别与啶酰菌胺、百菌清以不同比例混配,通过菌丝生长速率法测定混剂对B.cinerea的抑菌活性,并使用Bliss法、Mansour法、孙云沛法评价其联合作用。该研究结果能够为研究天然酚类化合物与杀菌剂混配奠定基础,同时能够为天然抑菌活性成分的利用和杀菌剂混剂研发提供新思路。

  1材料与方法

  1.1供试菌种

  本研究所用Botrytiscinerea病原菌采集于云南省玉溪市通海县玫瑰灰霉病病叶。分离纯化后经ITS测序鉴定确认,4℃条件下保存于云南农业大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室。保藏菌株经活化后用于抑菌活性测定。实验于2019年10月—2020年6月在云南农业大学和云南省农业科学院农业环境资源研究所进行。

  1.2供试化合物

  百里香酚(CAS:89-83-8,99%)购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;和厚朴酚(CAS:35354-74-6,98%)购买于安耐吉萨恩化学技术(上海)有限公司;百菌清(97%)、啶酰菌胺(97%)由广西田园生化股份有限公司提供;二甲基亚砜(AR)购于广州赛国生物科技有限公司。

  1.3抑菌活性测定

  采用菌丝生长速率法测定百里香酚、和厚朴酚、百菌清、啶酰菌胺及其混剂对B.cinerea的抑菌活性,方法如下:将百里香酚、和厚朴酚、百菌清、啶酰菌胺用二甲基亚砜配制成等比浓度梯度的母液,分别将百里香酚、和厚朴酚和百菌清、啶酰菌胺以10:1、5:1、3:2、2:3、1:5、1:10的比例混配。将待测药加入约45℃的PDA培养基中混匀后,倒入直径9cm的培养皿中制成带药平板,加入等量的二甲基亚砜作为对照。用内径为5mm的打孔器打取培养3天的B.cinerea菌饼置于平板中央,于25±1℃培养箱中黑暗培养,每个处理重复3次。待对照组菌落长至接近培养皿边缘时以十字交叉法测量菌落直径,用公式(1)计算抑菌率。抑菌率=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径×100%

  1.4混剂的增效作用测定及筛选

  结合Bliss法[18]、Mansour法[19]和孙云沛法[20]并加以优化,初步评价天然酚类化合物与百菌清、啶酰菌胺混配是否具有增效作用。流程如下:(1)分别测定百里香酚、和厚朴酚、百菌清、啶酰菌胺在不同浓度下对B.cinerea的抑菌活性,并计算其EC50值。(2)根据公式(2)[20],估算混剂的理论EC50值。

  2结果与分析

  2.1天然酚类化合物与百菌清、啶酰菌胺混配的增效作用

  百里香酚与百菌清、啶酰菌胺混配增效作用的定性分析结果。根据结果可知,百里香酚和百菌清以5:1、1:5和1:10比例混配时显示为增效作用,其中两者以1:5的比例混配时增效指数最高,为55.24,高于其他配比。百里香酚与百菌清在10:1、3:2、2:3的配比下混配时均为相加作用。百里香酚与啶酰菌胺在本次实验所选的6个配比组合下未筛选出具有协同增效的组合,均为相加作用。和厚朴酚与百菌清、啶酰菌胺混配增效作用的定性分析结果。和厚朴酚与百菌清混配在本次实验所设置的6个配比下显示为增效作用或相加作用,未见有拮抗作用的组合。和厚朴酚与百菌清在3:2、2:3的配比下为增效作用,以2:3的比例混配时增效效果最好,增效指数为55.12。和厚朴酚与啶酰菌胺混配在6个配比组合下均显示出相加作用。

  百里香酚、和厚朴酚与百菌清混配均筛选出了具有增效作用的配比。其中百里香酚与 百菌清以1:5比例混配、和厚朴酚与百菌清以2:3比例混配时增效作用为组中最高,增效指数分别为55.24、55.12。百里香酚、和厚朴酚与啶酰菌胺混配时均无增效的组合。初筛中百里香酚、和厚朴酚与百菌清混配均表现出增效作用或相加作用,为进一步测定其联合毒力,本研究采用孙云沛法测定其共毒系数,定量分析其增效效果。

  2.2增效配方的联合毒力

  百里香酚与百菌清及其混配的联合毒力测定结果。百菌清对B.cinerea的EC50为0.65mg/L,当百里香酚与百菌清混用之后,2:3、1:5、1:10比例下其EC50均低于0.65mg/L,其对B.cinerea的抑菌活性得到了提高,1:10时EC50最低,为0.30mg/L。百里香酚与百菌清以5:1、2:3、1:5、1:10的比例混配时其共毒系数大于120,均表现为协同增效作用,其中以1:5的比例混配时时协同增效作用最强,共毒系数为249.03,其次是1:10,共毒系数为237.49。

  百里香酚和百菌清在10:1和3:2时表现为相加作用。和厚朴酚与百菌清及其混配的联合毒力测定结果如表4所示。由表可知,和厚朴酚与百菌清以3:2、2:3、1:10的比例混配后EC50均低于百菌清单独使用时的EC50(0.65mg/L),对B.cinerea的抑菌活性得到了提高,其中以1:10混配EC50最低,为0.29mg/L。和厚朴酚与百菌清以1:5的比例混配时共毒系数为119.25,表现为相加作用,其他5个配比的共毒系数值均大于120,为协同增效。和厚朴酚与百菌清以10:1的比例混配时增效效果最好,其共毒系数为309.15。

  2.3混剂和单剂在不同浓度下的抑菌活性对比

  百里香酚与百菌清以1:5的比例混配时的共毒系数较其他比例混配时高,为249.03;两者以1:10混配时抑菌活性最高,EC50为0.30mg/L。和厚朴酚与百菌清以10:1混配时共毒系数为309.15,高于其他比例;两者以1:10混配时抑菌活性最高,EC50为0.29mg/L。为探讨这些混剂用于灰霉病防治的潜力,本研究对比了两种酚类化合物与百菌清混配后增效作用最明显和抑菌活性最高的混剂与百菌清单剂在一定浓度下的抑菌活性。结果表明:百里香酚与百菌清以1:5和1:10比例混配时,在0.125~8mg/L浓度下的抑菌活性均高于百菌清。

  如:百菌清在8mg/L浓度下对B.cinerea的抑菌率为87.55%,而百里香酚与百菌清以1:5和1:10比例混用后在2~8mg/L浓度下的抑菌率均为100%。和厚朴酚与百菌清以1:10比例混配时抑菌活性最高,2~8mg/L浓度下的抑菌率均为100%,在0.5~8mg/L浓度下的抑菌活性均高于百菌清;以10:1比例混配时共毒系数最高,二者之间表现出很强的协同增效作用,但混剂在0.5~8mg/L浓度下的抑菌活性均低于百菌清单剂。该结果是由于和厚朴酚的抑菌活性远低于百菌清所致。综合抑菌活性测定结果可知,将百里香酚、和厚朴酚与百菌清合理混配不仅能达到更好的杀菌效果,还能降低化学农药百菌清的使用量,具备用于灰霉病防治的潜力。

  3讨论

  目前,防治灰霉病混剂的研发以化学农药之间的混配为主。赵建江等[21-22]测定了啶酰菌胺分别与唑胺菌酯、嘧菌酯混配对灰葡萄孢菌的增效作用,结果表明啶酰菌胺与唑胺菌酯在9个质量比下混配对灰葡萄孢菌均表现为增效作用,1:3时增效明显,增效系数为4.76;啶酰菌胺与嘧菌酯以质量比7:1、5:1、3:1、1:1、1:5、1:3和1:7比例混配均表现增效作用,其中以1:1混配增效系数高达4.5。

  刘妤玲等[23]测定了吡唑醚菌酯和氟菌唑对番茄灰霉病的联合毒力,结果表明吡唑醚菌酯和氟菌唑以质量比2:1、1:1混配具有增效作用。与上述的化学合成杀菌剂间二元混配不同,本研究将天然酚类化合物与化学合成杀菌剂混配,发现百里香酚、和厚朴酚分别与百菌清混配不仅能够提高抑菌活性,而且能减少化学农药使用量。另外,不同作用机理的杀菌剂间的混配能够降低抗性风险、延缓灰葡萄孢菌抗药性的产生,可以作为开发灰霉病防治药剂的优选方案。

  4结论

  本研究将天然酚类化合物百里香酚、和厚朴酚与化学杀菌剂百菌清、啶酰菌胺进行混配,筛选出了具有增效的配方:百里香酚和百菌清以5:1、2:3、1:5和1:10混配,和厚朴酚和百菌清以10:1、5:1、3:2、2:3和1:10比例混配均表现出了一定的增效作用。其中和厚朴酚和百菌清以10:1比例混配时协同增效作用最明显,其CTC值为309.15,但其抑菌活性低于杀菌剂百菌清;以1:10比例混配时抑菌活性最高,其对B.cinerea的EC50为0.29mg/L,高于百菌清单剂。

  天然酚类化合物百里香酚、和厚朴酚与百菌清以合理比例混配具有防治灰霉病的潜力,本研究能为开发防治灰霉病的药剂提供理论支持。同时,本研究优化了混剂筛选方案:将Bliss法、Mansour法和孙云沛法3种农药混剂增效作用的评价方法结合,先进行配方的定性分析,初步筛选具有增效作用的配方,再进行定量分析,能够以更高的效率筛选具有增效作用的配方,对混剂筛选方法的优化具有一定的指导意义。

  参考文献

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  [4]肖景惠,逄飞,倪瑞琪,等.植物灰葡萄孢菌生物防治与化学防治机理的研究进展[J].中国蔬菜,2019(9):18-23.

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  [7]魏继刚,马峰,侯伟.50%啶酰菌胺水分散粒剂对番茄灰霉病的防治效果研究[J].陕西农业科学,2014,60(5):37-39.

  作者:李佳俊1,陶丽红1,叶敏1,王凯博1,2,吴文伟2,何成兴2,范黎明1,苏发武1

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