时间:2021年04月24日 分类:农业论文 次数:
摘要:为了解发酵培养料制备过程中微生物代谢产物的组成和变化规律,采用非靶向代谢组学技术,检测分析发酵2、4、6、8和10d时培养料的代谢组数据。结果表明:在正离子(POS)模式下,分别在T2vsT1、T3vsT2、T4vsT3和T5vsT4中筛选得到331、145、161和115种差异代谢物;在负离子(NEG)模式下,分别筛选得到251、159、106和76种差异代谢物。这些差异代谢物主要包括糖类及其衍生物、氨基酸、肽类及其类似物、脂肪酸类、维生素类、苯丙素类和聚酮类物质及其他次级代谢产物。此外,在发酵培养料中还含有植物生长调节剂(如吲哚-3-乙酸、茉莉酸和赤霉素)和抑菌物质(如绿原酸、抗生素、白藜芦醇)。该研究可为制备质量稳定的发酵培养料和掌握发酵培养料栽培平菇技术提供参考。
关键词:平菇;发酵料;代谢组学;差异代谢物
平菇Pleurotusostreatus(Jacq.)P.Kumm.,是世界上栽培最广泛的食用菌之一[1-3],也是重要的食药用真菌[4-5]。平菇的栽培技术主要有3种:生料栽培、熟料栽培和发酵料栽培[6]。与生料和熟料栽培相比,发酵料栽培平菇由于具有低污染、低成本、工艺简单和经济效益高的优点而在世界范围内得到了广泛应用[6]。
发酵论文范例:复合蛋白发酵酸奶饮料的稳定体系研究
平菇栽培用发酵料是以秸秆、玉米芯等农业副产物为主要原料,加入少量的麸皮、石灰等,在微生物的参与下,经短期、好氧发酵而制备的[3]。玉米芯约占玉米产量的21%,是一种产量巨大的农副产品,来源广泛、价廉易得[7]。目前,玉米芯除用于制备糠醛、木糖醇等外,很大一部分被作为农业废弃物直接燃烧,造成资源浪费和环境污染。
玉米芯组织均匀、硬度适宜、吸水性强,将其堆制发酵后用于平菇栽培,不仅有助于平菇产量和品质的提高,而且可以实现农业副产物的高效生物转化[8]。笔者在前期的研究中发现:平菇玉米芯发酵培养料制备过程中,变形菌门Proteobacteria在早期阶段(T1)占优势(相对丰度35.67%~44.10%),在高温阶段(T2,T3),厚壁菌门Firmicutes成为新的优势门(相对丰度41.50%~48.52%),而在堆肥后期(T4、T5),变形菌门重新成为优势门(相对丰度33.55%~36.89%)[9]。这些微生物对发酵过程中植物秸秆中木质纤维素的降解起着至关重要的作用。
Pearson相关分析表明,发酵培养料制备过程中的理化性质变化与其中微生物菌落的组成变化显著相关[9]。微生物能将培养料中复杂的有机质(纤维素、半纤维素、木质素等)进行降解,使其变成简单、易于利用的低分子物质;有些特定微生物如Actinobacteria、Thermus和Bacillus还可以产生抗菌、杀虫的物质,这可能是发酵培养料栽培平菇可以采用开放式接种的原因之一[10]。
目前对玉米芯发酵培养料的研究主要集中在栽培平菇[11-13]和制备过程中发酵培养料中微生物及其功能的演替方面[3],而对玉米芯发酵培养料制备过程中微生物代谢产物的研究还未见报道。代谢组学(metabolomics)是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后出现的新兴组学技术,是系统生物学的重要组成部分[14]。代谢组学是从整体角度出发,运用现代检测技术对尽可能多的代谢产物进行分析检测[15]。
目前,代谢组学在真菌领域的应用也日益广泛,为人们提供了一个了解真菌代谢的独特途径[14-16]。因此,笔者通过采用非靶向代谢组学技术分析检测玉米芯发酵培养料制备过程中发酵微生物代谢产物的种类和含量,进而探讨制备过程中主要代谢物的组成及变化规律,为稳定发酵料质量提供理论基础。
1材料与方法
1.1发酵料发酵料的质量分数配比为:玉米芯84%,麸皮10%,石灰5%,尿素1%;含水量68%。
1.2试剂与仪器玉米芯(中值粒径0.5cm)、麸皮、石灰、尿素均购自本地农贸市场;LC-MC级甲醇、水、甲酸、醋酸铵(CNWTechnologiesGmbH,Germany)。BSA124S-CW天平(Sartorius);1290UHPLC色谱仪(AgilentTechnologiesInc.,USA);TripleTOF6600质谱仪(ABSciexPte.Ltd.,USA);D3024R高速冷冻离心机(Scilogex,USA);JXFSTPRP-24全自动样品快速研磨仪(上海净信实业发展有限公司);GWB-1普析纯水仪(北京普析通用仪器有限责任公司);KS-7200DV超声仪(昆山洁力美超声仪器有限公司)。
1.3发酵料制备和取样
该试验于2020年3—4月在河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地进行。根据以往的报道[12],制备平菇发酵料。发酵料制备试验包含6个重复,每个重复包含250kg原料(干质量)。
玉米芯原料按照质量比为1∶2.4~2.5的料水配制,机械搅拌30min,堆置1d后进行建堆,堆高60cm,宽1.5m左右,长度不限。此时培养料的含水量约为70%,pH值9~10,颜色为金黄色。用直径5cm的木棒在料堆上部、横竖间隔30~40cm打通风孔,木棒要求插到料堆底部。发酵周期为10d,第3天温度升至45~55℃开始翻堆,培养料温度升至70℃以上每隔1d翻堆1次,共4次,直至发酵完成。分别在发酵2、4、6、8、10d时采集样品,标注为T1、T2、T3、T4、T5。为了获得具有代表性的样本,分别从发酵料堆的9个不同位置采集子样本,然后将子样本进行混合得到一个样本[3]。
1.4代谢组学分析
取发酵培养料样品进行代谢组学分析,按北京诺禾致源科技股份有限公司非靶向代谢组学分析方法提取代谢物、超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱(ultraperformanceliquidchromatography-quadrupoletime-of-flightmassspectrometry,UPLC-QTOF-MS)分析代谢物,采用ProteoWizard和XCMS软件对代谢组下机数据(.raw)实施峰的识别、提取、积分及对齐等处理。
利用mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和Masslist数据库进行峰比对,同时采用blank样本去除背景离子,进一步进行峰面积的批次归一化和自适换算标准化处理,从而得到代谢物的鉴定和定量结果。采用SIMCA软件(version14.1,sartoriusstedimdataanalyticsAB,Umea,Sweden)对数据进行主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis,OPLS-DA)[17]。
2结果与分析
2.1发酵培养料代谢物的主成分分析
基于非靶向代谢组学技术对发酵2、4、6、8、10d的培养料样品进行检测,分别在正离子(POS)和负离子(NEG)模式下鉴定得到1208和472种代谢物,对所有代谢物进行PCA分析。培养料样品中的代谢物分成5组,组内样本均集聚良好,这说明5组培养料样品的微生物代谢物具有显著的差异。为更充分地提取不同发酵时期培养料样品中代谢物的差异信息,分析筛选不同组间的差异代谢物,因此进一步采用有监督的OPLS‐DA分析数据。
T2vsT1、T3vsT2、T4vsT3、T5vsT4中的样品点均分布在不同的区域且明显分为两个簇,实现了两组样品间的完全分离。结果表明,不同发酵时期培养料样品中微生物代谢产物在种类和(或)含量上存在明显差异。
POS模式下T2vsT1、T3vsT2、T4vsT3、T5vsT4的OPLS‐DA模型质量参数分别为:R2Y(cum)=1.00,Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00,Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00,R2Y(cum)=0.98;R2Y(cum)=1.00,Q2Y(cum)=0.95。NEG模式下分别为:R2Y(cum)=1.00,Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00,Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00,Q2Y(cum)=0.98;R2Y(cum)=0.99,Q2Y(cum)=0.97。R2Y和Q2Y均大于0.5,这表明依据两种采集模式所得数据建立的OPLS‐DA模型都具有较好的拟合性和较强的预测能力。
3讨论与结论
笔者在本研究中采用非靶向代谢组学技术对不同发酵时期的平菇培养料中的代谢物进行分析,差异代谢物总数最多的是T2vsT1,其次是T3vsT2,最少的是T5vsT4。这与笔者前期对5个发酵时期培养料中微生物的代谢功能差异的分析结果基本一致[3]。发酵培养料中的漆酶、木聚糖酶和蛋白酶活性峰值出现在发酵降温阶段[3],表明木质纤维素和蛋白质的分解主要是在发酵后期发生,因此T2vsT1和T3vsT2时糖类及其衍生物和氨基酸、肽类及其类似物相对含量显著下降。
这可能是因为发酵前期(T2和T3)微生物代谢旺盛,需要大量的糖类和氨基酸以满足其生长和繁殖所需,导致T2和T3时发酵料中的糖类和氨基酸含量均较发酵前一时期(T1和T2)有所下降;到发酵后期(T4和T5),木质纤维素降解酶和蛋白酶活性大幅升高, 大量木质纤维素和蛋白质被降解生成低分子糖、肽类和氨基酸,因而其含量均比发酵前一时期(T3和T4)有所增加。发酵料中的Actinobacteria、Thermus和Bacillus属的微生物具有产生抑菌物质的能力[18]。
发酵料中的抑菌物质含量随发酵进程逐渐增加,为后期平菇开放式接种创造了良好的条件。这与笔者前期研究结果一致,随着发酵时间的延长,发酵料浸提液对青霉和木霉的抑制作用也随之增强[19]。维生素可以作为辅酶因子参与多种重要的生化反应,是生物不可或缺的生长因子。不同微生物之间可能凭借维生素的种间传递而建立相互作用关系,对微生物群落结构形成和功能发挥起着重要作用[20]。与抑菌物质含量变化趋势相似,发酵培养料中的维生素含量也较发酵前一时期有所增加。
在自然界中,木质纤维素可以被微生物分解成低分子的芳香族化合物,如水杨酸、阿魏酸等[21-22]。与T1相比,T2时期发酵培养料中的苯丙素类和聚酮类物质相对含量明显下降,这可能是因为微生物优先利用易降解的低分子物质,而T3、T4和T5时的苯丙素类和聚酮类物质相对含量分别比发酵前一时期有所增加,随着发酵的继续,玉米芯中易于降解的物质被利用完,微生物开始降解复杂高分子物质如木质素和酚类物质,进而生成了较多的低分子苯丙素类和聚酮类物质。
研究表明,植物生长调节剂如吲哚乙酸、赤霉素、脱落酸可以促进平菇菌丝的生长[23-24]。笔者前期研究发现,T5时期发酵培养料浸提液对平菇菌丝生长促进作用最为明显,尤其是体积分数为80%时,平菇菌丝生长速度和生物量分别比对照增加0.53cm·d-1和0.179g[25]。这可能与发酵培养料中的植物生长调节剂如脱落酸、吲哚-3-乙酸和赤霉素的相对含量均在发酵后期达到最高值有关。综上所述,不同发酵时期的玉米芯培养料中的微生物代谢产物具有明显的差异,并且其中含有丰富的抑菌物质和植物生长调节剂。该研究为平菇栽培获得稳定的发酵料质量提供了科学依据和理论基础。
参考文献
[1]NAMWL,SUMH,PHANGXY,etal.Productionofbio-fertilizerfrommicrowavevacuumpyrolysisofpalmkernelshellforcultivationofOystermushroom(Pleurotusostreatus)[J].ScienceofTheTotalEnvironment,2018,624:9-16.
[2]JAYASINGHEARACHCHIHS,SENEVIRATNEG.Canmushroomsfixatmosphericnitrogen[J].JournalofBiosciences,200429(3):293-296.
[3]KONGWL,SUNB,ZHANGJY,etal.MetagenomicanalysisrevealedthesuccessionofmicrobiotaandmetabolicfunctionincorncobcompostingforpreparationofcultivationmediumforPleurotusostreatus[J].BioresourceTechnology,2020,306:123156.
[4]戴玉成,杨祝良.中国药用真菌名录及部分名称的修订[J].菌物学报,2008,27(6):801-824.
[5]SÁNCHEZC.CultivationofPleurotusostreatusandotherediblemushrooms[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2010,85(5):1321-1337.
[6]HERNÁNDEZD,SÁNCHEZJE,YAMASAKIK.AsimpleprocedureforpreparingsubstrateforPleurotusostreatuscultivation[J].BioresourceTechnology,2003,90(2):145-150.
作者:刘皓皓1,刘芹2,崔筱2,靳荣线3,高玉千1,李亚楠1,孔维丽2,裴瑞杰4,邱立友1