百合LoNHX2基因的克隆与表达分析

　　摘 要：【目的】为了解决百合在北方盐碱地区百合种球生长和产量的问题。【方法】以 OT型百合 ‘Robina’为 材料，克隆了百合液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因 (LoNHX2)，并使用前期试验得出的半致死浓度200mM NaCl 对百合种球进行处理，通过荧光定量分析百合LoNHX2基因在盐处理后不同时间及不同部位的表达状况。 【结 果】结果表明：(1)百合LoNHX2基因全长为1608bp，编码525个氨基酸; (2)百合 LoNHX2蛋白性质稳 定，由20种氨基酸组成，为脂溶性蛋白;(3)200mM NaCl对百合种球根系进行盐胁迫处理后，LoNHX2基 因在百合根部的表达量随时间变化，呈先上升再下降趋势;(4)对百合盛花期不同部位中LoNHX2基因表达量 分析，LoNHX2基因在花瓣中表达量最高，其次是叶片、茎、根，表达量最低的是鳞茎。 【结论】发现百合 LoNHX2基因在盐胁迫中有重要作用，可通过降低细胞质中 Na+ 的浓度，从而降低高盐胁迫对植物细胞的伤 害。为百合种球耐盐分子育种提供理论依据，对百合在北方产业化发展及园林应用方面具有重要意义。

　　关键词：百合;盐胁迫;LoNHX2;基因克隆

　　百合多数品种喜微酸性土壤，但北方地区的土 壤偏碱，对百合根系造成持续盐碱胁迫，严重影响 种球生长和产量。目前对百合盐胁迫的研究主要 集中在生理生化特性研究，有报道0.8%～0.9%的 NaCl可能是百合所承受的最大盐胁迫浓度[1];刘艳 妮等在1%盐浓度胁迫下对亚洲百合进行抗盐性突 变体筛选，得到抗盐性诱变百合植株[2-3];左志锐等 比较2个百合的叶绿体和线粒体的超微结构，研究 了品种'Sorbonne'和'Prato'在 低 盐 处 理 下 的 结 构 变化[4]。

　　转运蛋白在营养物质摄取、代谢产物释放以及 信号转导等广泛的细胞活动中起着重要的作用[5]。 已有研究表明植物体内存在多个与 Na+ 转运相关 的蛋白，如液泡膜上的 Na+/H+ 逆向转运蛋白(vac- uolarNa+/H+ antiporter/exchanger，NHX)和 细 胞质 膜 上 的 Na+/H+ 逆 向 转 运 蛋 白 (SaltOverly Sensitive，SOS)[5]。液 泡 膜 NHX 蛋 白 主 要 行 使 Na+ 在液泡中区域化的功能，在提高植物耐盐性方 面发挥了重要作 用[6]。

　　He等 将 拟 南 芥 AtNHX1 转入棉花后发现，转基因棉花能在高浓度 NaCl条 件下正常生长[7]。目前，NHX2基因研究较多，已 在拟 南 芥[8]、羽 衣 甘 蓝[9]、番 茄[10]、小 麦[11]、大 叶 藻[12]等多种植物中克隆出来，并做了进一步研究。 另外，NHX 基因在转基因植物拟南芥、番茄、茄果 和水稻中也证实了耐盐性的改善[8]，但 NHX 基因 在百合中尚少有相关研究。

　　百合为盐敏感植物，土壤盐碱化现象一直是困 扰百合种植生产的重要问题，研究百合盐胁迫机理 及其耐盐适应性，在理论和应用方面都具有重要意 义。就此以 OT 型(东方百合与喇叭百合系间杂种) 百合‘Robina’为材料，用200mM NaCl对百合种球 进行处理，分析百合 LoNHX2基因在不同时间及 不同部位的表达状况，为研究百合盐胁迫下的基因 表达调控机理奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 植物材料

　　采用 OT 型百合品种‘Robina’为材料，取若干 种球种于北京农学院实验基地温室内，生长期间进 行常规管理，待生长30d后，用200mM NaCl溶液 对种植30d的百合进行处理，分别取处理后的0、6 h、12h、24h的百合根系，同时，取常规培养的盛花 期百合的根、茎、叶、花瓣、鳞茎，以上材料包上锡箔 纸快速放入液氮中备用。

　　1.2 百合 RNA的提取及cDNA的合成 使用 植 物 RNA 快 速 提 取 试 剂 盒 (EASYspin Plus，艾德莱)提取根系样品的总 RNA，用反转录试 剂盒(TaKaRa)合成cDNA，最后用紫外核酸蛋白测 定仪调节cDNA 模板浓度至基本一致。采用1.2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。

　　1.3 百合LoNHX2基因的克隆 根据课题组前期已有的百合转录组测序结果 中的非重复序列基因unigene，查找 LoNHX2基因， 对 LoNHX2基因的 unigene进行序列比对发现5′ 端较 完 整，3′端 有 缺 失。 参 照 3-′RACE 试 剂 盒 (TaKaRa)操作步骤分别进行 3′RACE 扩增，设计 3′RACE 特 异 性 引 物 3′GSP (GAAAAGTG- GAGATTTGTCAGCA)和 3′ NGSP (AATC- CCTATTTTCGTCGCTCAT)，并测序，通过DNA- MAN 软件拼 接，获 得 LoNHX2 基 因 全 长 cDNA。 再根据最大开放阅读框设计上游引物 LoNHX2-F (ATGGGTATCGATTTGGAGCCGG)和下游引物 LoNHX2-R(TCATTCCCATTCAGGGACGCTT )，以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 产物经琼脂糖 凝胶电泳，用 DNA 回收试剂盒(TaKaRa)进行切胶 回收，用pMD19-TVector连接转化并测序。

　　2 结果与分析

　　2.1 百合根系总 RNA提取质量分析

　　对提取的百合根系总 RNA 进行琼脂糖凝胶电 泳，电泳条带完整，可用于后续试验。

　　2.2 百合LoNHX2基因3’RACE克隆 在课题组前期进行的转录组测序结果中已有 的 LoNHX2 unigene 序 列 的 基 础 上，经 过 3’- RACE 后，将 目 的 条 带 进 行 切 胶 回 收、pMD19-T Vector连接转化及菌液测序，得到1条501bp条带 。

　　3 结论与讨论

　　本 研 究 根 据 转 录 组 测 序 中 已 知 的 百 合 LoNHX2基因片段序列，设计3’端引物，通过巢式 PCR扩增，克隆得到大小为 501bp的 3’端序列。 将克隆 得 到 的 3’端 序 列 与 已 知 序 列 拼 接，得 到 LoNHX2基因全长cDNA 序列，在最大开放阅读 框 ORF外设计全长特异性引物，经过 PCR 扩增得 到大小为1608bp的全长序列，其中包括起始密码 子 ATG 和 终 止 密 码 子 TGA，共 编 码 525 个 氨 基 酸。

　　用 DNAMAN 软件将其翻译为蛋白序列后发 现，百合 LoNHX2 蛋白的分子式为 C2751H4267N677 O736S28，相对分子量为59498.92，理论等电点(PI) 为7.27，该蛋白为脂溶性蛋白、稳定蛋白。LoNHX2 蛋白由20种氨基酸组成，蛋白由内向外有11个跨 膜螺旋，由外向内有12个跨膜螺旋，无信号肽。二 级结构中，α-螺旋(Alphahelix)和延伸链(Extended strand)所占比例最多。LoNHX2蛋白序列与拟南 芥、水 稻、玉 米 相 似 度 分 别 为 90.51%、89.42%、 90.69%。在獐毛中，用400mM NaCl处理6h后，根部 AINHX1基因的的表达量相对于茎部明显升高， 说明根部对盐胁迫更敏感。

　　在处理6h和12h时， 根部AINHX1基因的的表达量比对照 CK 分别上 升了6倍和8倍，处理24h后表达量降低[13]。本试 验结果与这一致。本试验中，在200mM NaCl处理 后，LoNHX2基因在百合根部的表达量呈先上升 再下降趋势。

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　　在处理0、3、6、12h时表达量逐渐升 高，处理24h时表达量降低。此外，在大麦[14]、水 稻[15]、灰绿狼尾草[16]中有相似的表达状况。说明 LoNHX2基因在植物盐胁迫中有重要作用，可降低 细胞质中 Na+ 的浓度，从而降低高盐胁迫对植物细 胞的伤害。 在百合不同部位 中，LoNHX2 基 因 在 花 瓣 中 表达量最高，其次是叶片、茎、根，表达量最低的是 鳞茎，说明LoNHX2基因的表达具有普遍性，在不 同部位表达差异量较大。这可能与在百合盛花期 时采集样 品 有 关，盛 花 期 时 花 瓣 中 各 细 胞 较 为 活 跃、代谢旺盛，所以 LoNHX2表达量较高，与此同 时叶片、茎等组织部位均已处于成熟期，所以表达 量较低。本研究克隆了百合 LoNHX2基因序列， 并分析了百合LoNHX2基因在不同时间及不同部位的表达状况，发现了LoNHX2基因的表达规律， 为研究百合盐胁迫下的基因表达调控机理提供了 理论参考。

　　参考文献：

　　[1] 华智锐.百合对盐胁迫的生理反应及转S6PDH 基因植株的抗 盐性鉴定[D].杨凌：西北农林科技大学，2007.

　　[2] 刘艳妮，王飞.百合离体抗盐变异体的筛选及生理特性研究 [J].西北林学院学报，2010，25(2)：70-75.

　　[3] 左志锐，高俊平，穆鼎，等.盐胁迫下百合两个品种的叶绿体和 线粒体超微结构比较[J].园艺学报，2006(2)：429-432.

　　[4] YAMAGUCHIT，HAMAMOTO S，UOZUMI N.Sodium transportsysteminplantcells[J].FrontiersinPlantScience， 2013，4：410.

　　[5] XU H X，JIANG X Y，ZHAN K H，etal.Functionalcharac- terizationofawheatplasmamembraneNa+/H+ antiporter inyeast[J].ArchivesofBiochemistryandBiophysics，2008， 473：8-15.

　　[6] YOKOIS，QUINTERO FJ，CUBERO B，etal.Differential expressionandfunctionofArabidopsisthaliana NHX Na+/ H+ antiportersinthesaltstressresponse[J].PlantJournal， 2002，30：529-539

　　作者：王安琪，薛晓霞，左 杨，张克中，崔金腾