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大豆FUL基因家族进化规律分析及基因编辑靶点鉴定

时间:2021年02月25日 分类:农业论文 次数:

摘要:栽培大豆起源于我国黄淮海地区,我国具有悠久的大豆种植历史和丰富的大豆遗传资源。然而,近年来我国大豆进口依赖度极高,严重威胁到我国的粮食安全,因此培育高产优质的大豆品种至关重要。株高,籽粒大小等是影响大豆产量的重要农艺性状,因此,挖掘

  摘要:栽培大豆起源于我国黄淮海地区,我国具有悠久的大豆种植历史和丰富的大豆遗传资源。然而,近年来我国大豆进口依赖度极高,严重威胁到我国的粮食安全,因此培育高产优质的大豆品种至关重要。株高,籽粒大小等是影响大豆产量的重要农艺性状,因此,挖掘调控这些农艺性状的基因,及解析其分子机制具有重要意义。FRUITFULL(FUL)基因属于MADS-box类转录因子,在植物的开花,生长发育,果实成熟等方面起着重要的作用。本研究通过生物信息学分析发现,在大豆中含有6个FUL基因,它们均具有一个保守的MADS-box和一个较为保守的K-box结构域,并主要在豆荚中表达,说明该基因家族可能能够调控大豆种子相关性状。其中,只有GmFUL3b基因在叶片中高度表达,说明该基因在进化过程中功能可能产生了分化。此外,还发现6个FUL之间的进化规律不同。为进一步确定其生物学功能,利用CRISPR/Cas9技术,分别构建6个FUL基因的敲除突变体载体,转化大豆毛根进行靶点验证,并成功鉴定出其中5个基因的有效靶点,为进一步获得稳定的大豆突变体材料及解析GmFULs家族基因的功能提供了重要的理论基础。

  关键词:大豆;FUL基因;生物信息学分析;CRISPR/Cas9技术

大豆基因

  大豆(Glycinemax)是世界上重要的粮食兼经济作物之一,也是人类主要的植物蛋白来源[1]。大豆具有非常高的营养价值[2],例如,大豆蛋白中所含人体必需氨基酸的含量与肉类相近,同时大豆油脂中的人类必需脂肪酸也较为丰富。栽培大豆起源于我国黄淮海地区[3],目前主要种植在西北地区、东北地区、黄淮海地区和南方地区[4-5]。我国生产的大豆仅能满足国内食品加工消费需求,饲料使用的大豆仍然需要依赖大量的进口来维持,从2015年至今对外依存度始终超过80%,年均进口量超过8000万吨左右。因此,提高大豆产量具有重大的战略意义[6]。通过分子育种技术能够更加有目的性,更加快捷地培育新品种,因此找到控制大豆生长发育相关基因,并理清这些基因之间的调控机制是培育高产量大豆品种的关键。

  农作物论文范例:重茬大豆高产栽培技术

  MADS-box类转录因子家族在植物的生长发育与信号转导过程中发挥着重要的作用[7]。MADS-box家族蛋白具有一个由56~58个氨基酸组成的高度保守区域——MADS-box,和一个约由70个中度保守结构域氨基酸组成的K-box。MADS-box类转录因子一般能够形成同源或异源二聚体,例如,拟南芥中MADS-box家族的AGAMOUS(AG)、APETALA1(AP1)、AGAMOUS-LIKE(AGL)和NMHC5的蛋白能够与自身形成同源二聚体[8],而APETALA3(AP3)/PISTILLATA(PI)、NoduleMADS-boxHomologue7(NMH7)/NGL9能够形成异源二聚体[9-10],从而能够结合特定的DNA序列调控基因的表达。

  在花器官发育的ABCDE模型中[11],绝大部分控制花发育的基因都属于MADS-box家族,例如,AP1、CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)同属于MADS-box的AP1/FUL亚家族的A类基因,且三者在控制花分生组织特异性发育的功能方面具有冗余性[12]。其中,FUL基因在控制植物的生长发育具有非常重要的作用,且在不同物种中的功能上存在差异。例如,在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中只含有1个FUL基因,FUL不仅参与控制开花时间,而且对于维持花序分生组织继续发育成花的过程具有调控作用,并能够抑制其逆转为营养分生组织[13]。

  此外,FUL基因还参与调控拟南芥叶片的发育[14],角果的伸长[15]以及裂片细胞的发育[16]。在番茄(Solanumlycopersicum)中有3个FUL的同源基因,分别为TM4[17],SLMBP7[18]和SLMBP20[19]。其中,TM4与拟南芥FUL同源性最高,它能够和SEPALLATA-LIKE(SEP-like)编码的蛋白RIPENINGINHIBITOR(RIN)相互作用,同时也能和SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1-LIKE(SOC1-like)编码的蛋白TM3相互作用,协同控制番茄开花时间和果实成熟[20]。FUL基因在不同植物组织中的表达也存在着差异,例如在水稻(Oryzasativa)中存在2个FUL同源的基因,分别为OsMADS18[21]和OsMADS14[22]。OsMADS18在水稻所有的组织中均有表达,OsMADS14只在花发育的特定阶段表达[23]。在陆地棉(Gossypiumhirsutum)中,FUL-like基因GhMADS22在发育中的茎尖、苞片和萼片中高度表达,可以促进开花和延缓衰老[24]。

  黄瓜(Cucumissativus)中有两个FUL的旁系同源基因Csa004592和Csa004120。它们主要在黄瓜的花与初期的果实中表达,可能通过细胞周期相关基因来控制细胞分裂与细胞大小,从而调控黄瓜果实的长度[25]。尽管FUL基因对植物的生长发育至关重要,但在大豆中的FUL基因的功能尚未见报道。CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛应用于植物突变体的创制,对深入解析基因的功能具有重要的作用。目前,在拟南芥[26]、烟草[27]、水稻[28]、小麦[29]、大豆[30-31]、玉米[32]、番茄[33]等多种模式植物及农作物中成功实现了基因定向敲除。

  例如,Cheng等[30]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功创制了大豆LATEELONGATEDHYPOCOTYL(LHY)四突突变体植株,发现纯合四突变体植株导致株高降低,节间距缩短。Chen等[31]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了大豆GmAP1纯合四突变体,并发现GmAP1对大豆开花与株高具有重要的影响。本研究利用蛋白质同源比对和进化树分析的方法鉴定出大豆中含有6个GmFUL基因,参照Cao等[34]将其命名为GmFUL1a、GmFUL1b、GmFUL2a、GmFUL2b、GmFUL3a、GmFUL3b,并通过生物信息学分析,对该家族基因的功能进行了初步分析,同时,利用CRISPR/Cas9技术成功构建了GmFUL家族基因的敲除载体,为创制稳定大豆GmFUL家族基因的多突变体及进一步研究该基因家族在大豆中的生物学功能提供了理论基础。

  1材料与方法

  1.1试验材料

  植物材料为大豆品种Williams82(W82)、发根农杆菌菌株为K599,由广州大学分子遗传与进化创新研究中心实验室保存。CRISPR/Cas9载体构建质粒AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29、CRISPR/Cas9,由华南农业大学刘耀光实验室提供。DH5α感受态细胞购买自深圳康体生命科技有限公司,BsaI酶、T4连接酶购买自NewEnglandBiolabs公司,DNA提取试剂盒购买自北京康为世纪生物科技有限公司,高纯度小量质粒试剂盒购买自北京全式金生物技术有限公司。

  1.2同源比对及进化树分析

  在Phytozome12数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/)中,搜索拟南芥AtFUL基因在大豆中的同源基因,并获取同源基因的氨基酸序列。在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BLAST比对与CD-Search功能,获取与大豆中FUL家族基因同源性较高的其他豆科基因序列及其结构域相关信息。利用DNAMAN软件(Highlighthomologylevel设为大于50%),对FUL蛋白的氨基酸序列进行同源比对。利用NCBI数据库查询各个同源基因的UTR和CDS以及其蛋白序列的结构域,最后利用MEGA_X软件中Neighbor-Joiningtree法(Bootstrap值设为1000)构建系统进化树。

  1.3共线性化分析

  从Phytozome12数据库上下载拟南芥品种ArabidopsisthalianaTAIR10与大豆品种W82的基因组序列,利用TBtools[35]软件对这两个物种进行共线性化分析,标注出AtFUL基因与大豆GmFUL1a、GmFUL1b、GmFUL2a、GmFUL2b、GmFUL3a、GmFUL3b基因之间的联系。

  2结果与分析

  2.1进化树与同源比对

  在Phytozome12数据库中,搜索并下载与拟南芥生物钟基因AtFUL(AT5G60910)同源的大豆基因序列,发现在大豆中存在6个FUL基因,分别命名为GmFUL1a(Glyma.04G159300.1)、GmFUL1b(Glyma.06G205800)、GmFUL2a(Glyma.05G018800.2)、GmFUL2b(Glyma.17G081200.1)、GmFUL3a(Glyma.08G250800.1)、GmFUL3b(Glyma.18G273600.1)。为了进一步分析大豆中的FUL基因家族蛋白的功能是否具有保守性,在NCBI数据库中搜索并下载与AtFUL基因同源的其他豆科植物的氨基酸序列。

  利用DNAMAN软件与MEGA软件,将6个FUL与4个豆科植物,分别为菜豆(Phaseolusvulgaris,XM_007138315.1)、非洲相思子(Abrusprecatorius,XP_027339183.1)、豇豆(Vignaunguiculata,XP_027942348.1)、木豆(Cajanuscajan,XP_020234496.1)的氨基酸序列进行同源比对及系统进化树分析。结果表明,在不同的豆科植物中,FUL蛋白均存在2个保守结构域:MADS-box结构域和K-box结构域。其中MADS-box结构域位于1~77位氨基酸,保守率达92.89%。K-box结构域位于88~174位氨基酸,保守率达82.65%。

  从系统进化树中可以看出,GmFUL1a和GmFUL1b聚类在一个分支中,且与豆科植物聚类在一起,说明GmFUL1a/1b编码的蛋白可能是豆科作物中比较保守的蛋白,而拟南芥AtFUL与GmFUL2a/2b亲缘关系较近,说明GmFUL2a/2b可能与AtFUL的生物学功能较为相似,GmFUL3a和GmFUL3b聚类在一个分支中,且并未与其他FUL蛋白聚类在一起,说明GmFUL3a和GmFUL3b编码的蛋白可能与其他的FUL蛋白功能不同。用MEME网址对该11个蛋白进行基因结构分析,发现11个FUL基因可分为2大类,其中GmFUL2a/b、GmFUL3a/b与AtFUL被归为为一类,GmFUL1a/b与菜豆、豇豆、木豆的FUL基因被归为一类。

  3讨论

  在MADS-box转录因子家族中,一般存在两个结构域,MADS-box结构域能够与特异的DNA序列结合,并调控下游基因的表达。K-box主要参与蛋白二聚体和多聚体的特异性结合。C末端是序列和长度最具变化的结构域,主要负责转录激活和参与蛋白多聚体复合物形成,这3个关键的结构域在维持转录因子活性、发挥正常功能起重要作用[39]。大豆GmFULs蛋白属于MADS-box转录因子家族的成员。

  与其他植物的FUL同源蛋白相比,大豆GmFULs蛋白在MADS-box与K-box结构域的氨基酸组成与序列长度上都十分保守,但GmFUL3a/b在C末端的氨基酸序列具有较大差异,推测GmFULs在功能上会呈现一定的保守性,同时GmFUL3a/b与GmFUL1a/b、GmFUL2a/b可能会呈现一定的功能分化。在被子植物系统发育过程中,单子叶植物和基部被子植物的MADS-box基因只有FUL-like进化支,伴随核心真双子叶植物的起源与演化而产生了序列重复和功能分化成euAP1、euFUL和FUL-like3个分支[40]。而真双子叶植物euFUL型基因是由祖先的FUL-like基因通过1次主要的基因重复后产生的[41]。

  在大豆与拟南芥、大豆自身的共线性分析中表明,GmFUL1b、GmFUL2b、GmFUL3a可能来自于拟南芥的FUL基因,而GmFUL1a、GmFUL2a、GmFUL3b可能通过自身FUL基因发生的一次基因重复事件而产生。植物中MADS-box基因不同的表达模式与其功能有明显的相关性。例如,豆科植物苜蓿(Medicagotruncatula)中有3个FUL-like型基因,其中MtFULa和MtFULb在生长发育阶段均有表达,但在开花前表达量最高,主要参与促进植物开花;而MtFULc在开花后表达量最高,主要参与促进花的发育[42]。

  禾本科植物小麦(Triticumaestivum)具有3个FUL同源基因,分别是WFUL1、WFUL2和WFUL3,它们之间也存在着功能分化。WFUL1在叶片中表达,WFUL2调控花分生组织特性决定、外稃和内稃的发育,WFUL3则参与调控果实的发育[43]。而油菜(Brassicanapus)的FUL-like基因则具有参与调控长角果开裂的功能[44]。不同植物中的FUL-like基因可能由于氨基酸序列或基因结构的差异,导致表达模式产生差异,并主要参与其表达量最高的组织内的发育与调控。

  我们的研究中发现,GmFUL1a/b、GmFUL2a/b、GmFUL3a的组织特异表达较为相似,主要在花器官和豆荚的表达较高,而GmFUL3b与其他的GmFULs基因不同,它在叶片的表达量远高于其在花器官和豆荚中的表达量。推测GmFUL1a/b、GmFUL2a/b、GmFUL3a这五个基因在果实发育的过程中,可能起着重要的作用。而GmFUL3b可能在调控开花等途径中具有重要功能。

  通过对FUL家族基因的深入生物信息学分析后,发现尽管不同的FUL之间在氨基酸序列及基因结构中较为相似,但其进化规律及表达模式并不相同,因此推测它们之间可能在功能上存在差异,为了更加深入解析不同FUL之间的功能差异,在今后的研究中将进一步获得不同FUL基因的单突变体,并观察其农艺性状,为应用到大豆育种中,提供重要的理论依据。

  目前CRISPR/Cas9系统已经成功在各种重要作物中实现了基因编辑,如拟南芥、水稻、玉米及大豆等[45]。尽管CRISPR/Cas9技术较传统方法更加高效便捷,但是在大豆的应用中仍然会出现编辑效率较低的情况。因此在构建Cas9载体时,需要设计两个或两个以上的敲除靶点,再通过发根转化实验对靶点效率进行验证检测,确保大豆的编辑效率。

  本研究成功利用CRISPR/Cas9技术成功构建用于诱导大豆GmFULs突变的Cas9载体,同时结合根毛转化系统与CRISPR/Cas9技术,验证了3个靶点GmFUL1T1、GmFUL2T1、GmFUL3T1能够有效编辑5个基因(GmFUL1a/b、GmFUL2a/b、GmFUL3a),提高了检测靶点的编辑效率,为挑选编辑效率高且特异性好的靶点再进行大豆全株转化节省了大量时间。而GmFUL3b基因未被靶点GmFUL3T2、GmFUL3T3成功编辑,证明设计的这两个敲除靶点脱靶率较高,需要重新设计GmFUL3b基因的特异性靶点并进一步进行靶点效率的验证。

  参考文献

  [1]高运来,姚丙晨,刘春燕,李文福,蒋洪蔚,李灿东,张闻博,胡国华,陈庆山.黑龙江省主栽大豆品种遗传多样性的SSR分析.植物学报,2009,44(5):556-561GaoYL,YaoBQ,LiuCY,LiWF,JiangHW,LiCD,ZhangBW,HuGH,ChenQS.Analysisbysimplesequencerepeatsofsoybean(Glycinemax)varietiesfromHeilongjiang.ChineseBulletinofBotany,2009,44(5):556-561

  [2]MohantyBP,GangulyS,MahantyA,SankarTV,AnandanR,ChakrabortyK,PaulBN,SarmaD,SyamaDJ,VenkateshwarluG,MathewS,AshaKK,KarunakaranD,MitraT,ChandaS,ShahiN,DasP,DasP,AkhtarMS,VijayagopalP,SridharN.DHAandEPAcontentandfattyacidprofileof39foodfishesfromIndia.BioMedResearchInternational,2016,4027437

  作者:黎永力,杜浩,李泰,甘卓然,侯智红,董利东,刘宝辉,程群

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