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低温胁迫下产生物表面活性剂的海洋石油降解菌性能

时间：2019年10月22日 分类：农业论文 次数：

摘要在大连东港被原油污染的潮间带筛选出一株能在低温胁迫下产生物表面活性剂的石油降解菌，命名为DG-1。通过16SrRNA基因测序方法鉴定该菌株为盐单胞菌。在4℃的低温下，经过15、30、60d的降解培养后，分别有14%、41%和58%的原油被该菌株降解。菌株DG-1可利

　　摘要在大连东港被原油污染的潮间带筛选出一株能在低温胁迫下产生物表面活性剂的石油降解菌，命名为DG-1。通过16SrRNA基因测序方法鉴定该菌株为盐单胞菌。在4℃的低温下，经过15、30、60d的降解培养后，分别有14%、41%和58%的原油被该菌株降解。菌株DG-1可利用柴油和原油为碳源产生物表面活性剂，其中以柴油为唯一碳源时发酵液的表面张力可降低至32.4mN/m。薄层色谱和红外光谱实验结果表明所产的表面活性剂为糖脂类表面活性剂。

　　关键词低温石油降解菌生物降解生物表面活性剂

高分子活性剂

　　目前还未发现能完全替代石油的清洁能源[1];但是随着石油的开采、储运和加工，石油污染对环境和人类健康的危害越来越大[2]。潮间带处于海陆生态交错区，生态系统服务价值巨大但是环境较为敏感，溢油事故往往对其造成严重危害。如果溢油发生在寒冷季节，在低温胁迫下易挥发的石油组分蒸发速率降低，长链烷烃的石油烃组分呈不溶状，从而导致石油污染物持续存在[3]。

　　此外，低温也加大了石油污染清除工作的难度。因此发生在低温时的溢油事故往往危害更大。例如ExxonValdez油轮溢油事故污染了约1700km的海岸带，大量海鸟、海獭和鱼类死亡，对周围环境的影响一直持续到现在[4，5]。生物方法具有效率高、费用低、不需大型设备和生态友好等特点[6]，在清除海岸带等生态敏感区的石油污染时优势明显。微生物修复属于生物修复的一种，细菌结构简单、适应性强，常被用于污染物的微生物修复[7]。

　　但是在低温条件下，常温菌活性降低，而且石油烃的生物可利用性也降低[8]。尽管低温不利于石油烃的生物降解，但自然界存在能够降解石油烃的低温石油降解菌，并且有些低温菌能够通过产生物表面活性物质来提高对石油烃的利用率[9—11]。目前对产表面活性剂的海洋石油降解菌的研究主要集中在常温菌，对低温菌研究的较少，特别是对筛选自海洋环境的产表面活性剂的低温菌株研究极少[11，12]。

　　中国北方海区是重要的石油开发区，近年来在冬季发生多起溢油事故。如“东方大使”轮触礁事故、“塔斯曼海”油轮碰撞事故、“锦集7”号轮沉船事故等，危害海洋环境[13—15]。因此，研究低温时溢油事故的处理技术对保护中国北方海域十分必要。本研究的目的在于中国北方海域筛选能产表面活性剂的低温石油降解菌并研究其性能。

　　1实验材料与方法

　　1.1培养基

　　实验用到两种培养基:MMC培养基和2216E培养基。

　　1.2方法

　　1.2.1采样

　　石油污染海水样品采自位于大连东港商务区的一片岩石潮间带，该区域被原油污染。取表层水样装入无菌广口玻璃瓶中，带回实验室放入冷藏柜4℃保存。

　　1.2.2菌株筛选

　　采用传统的摇瓶法筛选菌株，培养温度为4℃，采用原油作为唯一碳源。采用稀释涂布法将富集液中的细菌进行分离，采用平板划线法将分离的菌落纯化。采用排油圈法挑选产表面活性剂的菌株。

　　1.2.3菌株的生理生化反应

　　对所筛选出的菌株进行革兰氏染色和氧化酶实验、VP实验、吲哚实验、明胶液化实验和硫化氢产出等生理生化实验。

　　1.2.416SrRNA基因测序

　　采用16SrRNA基因测序的方法进行菌株鉴定。引物为27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。将引物在6000r/min下离心3min后稀释100倍。挑取适量菌体置于装有50μL的PCR裂解缓冲液的离心管中，振荡混匀，于80℃水浴温育15min，离心分离，将上清液转至另一离心管进行PCR。PCR反应步骤:在循环前进行94℃加热5min，进入循环(30次)94℃停留30s54.5℃停留30s、72℃停留30s、循环之后72℃停留7min，4℃保持。

　　称取0.45g琼脂糖加入到30mLTAE缓冲溶液中，加热直至琼脂糖由浑浊变为澄清透明。加入60mL于半板，等琼脂糖缓冲溶液温度降至40～50℃，加入3μLDNA染色剂。吸取5μLPCR产物放入凝胶托盘孔内，电泳30min后放入紫外灯箱内观察是否出现明显条带。委托上海立菲生物技术有限公司进行测序。

　　1.2.5降解性能测定

　　挑取菌体转移至装有100mL已灭菌2216E液体培养基的瓶锥形中振荡培养。将5mL菌液加入到含有1mL柴油的100mLMMC培养液中，于4℃下培养分别培养15d、30d、60d。以不接种菌液的培养液作为空白组。降解培养结束后，在培养液中加入3mL50%的硫酸溶液进行酸化。

　　用20mL的石油醚萃取三次。将萃取后的油相采用紫外分光光度法测石油烃含量。降解率D的计算公式为D=[(C0-C1)/C0]×100%。其中，C0为空白瓶中石油烃的浓度，C1为实验瓶中石油烃的浓度。采用可见光分光光度计在600nm的波长下测定发酵液水相的吸光度。

　　1.2.6产表面活性剂性能测定

　　将菌体转至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基的瓶锥形中，低温振荡培养3d(4℃，120r/min)形成降解菌母液。分别利用柴油和原油为碳源，考察菌株产表面活性剂的情况。按照5%的比例将降解菌母液移至已灭菌的MMC液体培养基中，然后分别加入1%的碳源。在4℃条件下低温振荡培养30d。以不接种降解菌的培养液作为空白组。

　　降解培养结束后，发酵液离心去除菌体后用盐酸调节至pH=2.0，在4℃下冷藏过夜。使用表面张力仪测定发酵液的表面张力。

　　1.2.7表面活性剂制备与鉴定

　　用氯仿-甲醇(2∶1，体积比)混合液萃取发酵液中的表面活性剂，将萃取液旋转蒸发后得到物质为生物表面活性剂。将提取的表面活性剂样品干燥后进行红外光谱分析。另外，也采用薄层层析法鉴定表面活性剂种类。展开剂为V氯仿∶V甲醇∶V水=70∶10∶0.5。将1g蒽酮和5mL浓硫酸溶于95mL乙醇中作为显色剂。

　　将表面活性剂溶液用毛细管滴点样于离薄层板一端1cm处，晾干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，待展开剂上升至离薄层板顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷显色剂，放入95℃烘箱中加热10min，取出观察显色情况。

　　2实验结果与讨论

　　2.1菌株的筛选

　　根据菌落生长速度、菌落数量和大小、产生的溶解圈直径大小等条件从分离出的菌株中选出一株优势菌，命名为DG-1。该菌株的菌落呈乳白色、湿润、圆形、光滑、隆起、边缘规则。

　　2.2菌株的生理生化特征

　　菌株DG-1的革兰氏染色结果为阴性。氧化酶实验、VP实验、吲哚实验、明胶液化实验等生理生化实验的实验结果。

　　2.3菌株鉴定

　　在NCBI网站利用BLAST对菌株的基因序列进行对比分析，选取与菌株DG-1亲缘相近菌株的序列，通过Mega6软件进行系统发育分析，菌株DG-1为盐单胞菌(Halomonas)菌属的细菌。

　　2.4降解性能分析

　　在降解培养的初始阶段，原油呈黑色薄膜状漂浮在液面上，水相澄清。随着降解培养的进行，原油油膜分散，部分原油呈油滴状态，溶液变浑浊。培养后期，有絮状物沉淀于瓶底，也有细小的黑色屑状物质悬浮于溶液中，溶液呈褐色浑浊状态。表明原油被菌株DG-1逐步降解。

　　结果表明，菌株DG-1在4℃的低温下依然保持活性，能较高效地降解原油。降解的初期原油降解率较低，之后上升较快，30d后原油的降解率趋向于缓慢上升。原油的降解率和溶液中菌株的丰度存在线性关系，菌株丰度越高则原油降解率越高。

　　2.5产表面活性剂分析

　　在4℃条件下，菌株DG-1利用柴油和原油为碳源进行发酵培养30d后，可将发酵液表面张力分别降低至32.4、53.5mN/m。菌株DG-1所产表面活性剂的红外光谱实验。可发现C—O—C键、C—H、CO键的吸收峰，可以推测该生物表面活性剂为糖脂类表面活性剂。此外，薄层层析板上显现棕色斑点，也说明该表面活性剂为糖脂类表面活性剂。

　　3结论与展望

　　本研究筛选出一株能在4℃的低温条件下降解原油的菌株，该菌株在降解原油和柴油的过程中能代谢生物表面活性剂从而提高石油烃的生物利用率。因此，该菌株具有应用于中国北方海域冬季溢油原位修复工作的潜力。本研究的结果可以为海洋溢油的微生物修复提供优良菌源和基础数据。但论文中很多的研究工作还处于初始阶段，未来应进一步深化研究。

　　参考文献

　　1VarjaniSJ，RanaDP，JainAK，etal.Synergisticex-situbiodegradationofcrudeoilbyhalotolerantbacterialconsortiumofindigenousstrainsisolatedfromonshoresitesofGujarat，India[J].InternationalBiodeteriorationandBiodegradation，2015，103:116-124

　　2HeadIM，JonesDM，RolingWF，etal.Marinemicroorganismsmakeamealofoil[J].NatureReviewsMicrobiology，2006(4):173-182

　　3AtlasRM.Microbialdegradationofpetroleumhydrocarbons:anenvironmentalperspective[J].ClinicalMicrobiologyReviews，1981，45(1):180-2094PiattJF，LensinkCJ，ButlerW，etal.Immediateimpactofthe“exxonvaldez”oilspillonmarinebirds[J].AmericanUniversityofKuwait，1990，107(2):387-397

　　相关论文范文阅读：环境科技论文水中阴离子表面活性剂自动测量方法研究

　　摘要：在GB 7494―87基础上，将流动注射分析法与分光光度法相结合，利用蠕动泵及聚四氟乙烯管路进行萃取、反应和测量，将手动分析方法变成全自动的分析方法.研究表明，该方法测量阴离子表面活性剂的质量浓度范围为0～2.0 mg・L-1，最低质量浓度检出限达0.01 mg・L-1，相对标准偏差小于3.11%，加标回收率在85%～95%之间，均符合标准方法的要求.新的测量方法既保留了流动注射法快速、便捷、准确度高、稳定性好、环保等优点，同时又克服了流动注射法拖峰、管路复杂、易受气泡干扰等缺点.

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