聚苯乙烯纳米塑料对大蒜生长生理的影响

　　摘要：自然环境中的微/纳米塑料污染日趋严重，但纳米塑料对农作物生长的潜在影响尚不清楚。通过营养液培养方式，探讨了粒径为80nm的聚苯乙烯纳米塑料(polystyrenenanoplastics,PS-NPs)对金乡大蒜(AlliumsativumL.)叶绿素含量、抗氧化性能和营养品质的影响。结果显示，添加PS-NPs处理的大蒜，其叶片叶绿素含量均显著低于对照组，叶绿素的合成受到抑制。大蒜叶片SOD、APX活性和脯氨酸含量随着PS-NPs质量浓度的增加呈先升高后降低的趋势。10d处理时大蒜叶片POD活性随PS-NPs质量浓度的增加而上升，但在20d处理时，各处理组POD活性均受到抑制。大蒜叶片MDA含量随PS-NPs质量浓度的增加而增加，在ρ(PS-NPs)为100mg·L-1处理下，10d和20d处理时其含量相比对照分别增加43.24%和89.70%。同时，经ρ(PS-NPs)为100mg·L-1胁迫处理10d后，大蒜叶片可溶性蛋白质、可溶性糖和维生素C含量均高于对照组，但20d后，维生素C含量较对照则降低了26.53%。以上结果表明PS-NPs能对大蒜产生较为显著的氧化胁迫效应，且较高质量浓度的PS-NPs胁迫会对大蒜叶片的营养品质产生一定的影响。

　　关键词：金乡大蒜;纳米塑料;生长生理;抗氧化酶;营养品质

　　据统计，全球每年塑料生产量已超过3.2亿t，多达74%的塑料垃圾最终被排放到环境中[1]。在物理、化学和微生物等作用下，塑料垃圾会被分解成无数微小的塑料碎片或颗粒[2]。同时，个人护理品中的塑料微珠以及人造纺织品聚合纤维等微塑料，也会直接进入环境。早在2004年，英国学者Thompson等[3]在研究海洋塑料垃圾污染时提出“微塑料”这一概念。

　　一般认为，当塑料碎片或颗粒的尺寸小于5mm时，即被定义为微塑料[4]。理论上，环境中的微塑料仍然会进一步分解，最终可形成尺寸小于100nm的纳米塑料[5]。Besseling等[6]通过研究证实，在条件充分时，一个微塑料颗粒可以破碎成1014个以上的纳米塑料。纳米塑料体积小，比表面积大，使其很容易吸附携带其它污染物[7]。相较于微塑料，纳米塑料也更容易被生物体吞食或被动摄入[8]，然后通过食物链在高营养层生物体内富集[9,10]，其毒性实验也表明纳米塑料对生物体和人类健康存在潜在危害[11]。

　　近年来，陆地生态系统中纳米塑料污染受到广泛重视，尤其是农业生态系统中的纳米塑料对农作物生长的潜在危害[12-16]。连加攀等[17]的研究指出，粒径为50nm的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、线性低密度聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯纳米塑料能够对小麦(TriticumaestivumL.)种子的发芽和生长产生抑制作用。Jiang等[18]的研究发现100nm的聚苯乙烯微球能够干扰蚕豆(ViciafabaL.)生长过程中营养物质的运输，并对作物产生遗传毒性。

　　Giorgetti等[19]的研究结果也表明：50nm的聚苯乙烯微球能诱导洋葱(AlliumcepaL.)细胞毒性(降低有丝分裂指数)、基因毒性(细胞遗传异常和微核的诱导)和氧化损伤。整体而言，关于纳米塑料对高等植物的影响研究仍然偏少，纳米塑料对作物生长和品质的影响尚不清晰。大蒜是著名的食药两用植物，其蒜头和蒜叶均可作蔬菜食用。聚苯乙烯是使用最为广泛的塑料材料，常用于塑料杯、塑料薄膜等包装盒和建筑保温等产业，已成为土壤、湖泊和海洋的主要污染物[20]。因此，本研究选用广泛种植的金乡大蒜(AlliumsativumL.)作为供试材料，以粒径为80nm的聚苯乙烯纳米颗粒(polystyrenenanoplastics,PS-NPs)作为胁迫物质，探讨不同质量浓度的PS-NPs对大蒜叶片叶绿素含量、抗氧化性能和营养品质的影响，以期为后续评估纳米塑料对农作物的影响提供参考依据。

　　1材料与方法

　　1.1塑料微球

　　本研究采用由Nileblue荧光染料标记的红色荧光PS-NPs，购自大鹅(天津)科技有限公司。PS-NPs呈球形，平均粒径为80nm，变异系数<5%，在水相中分散和保存，原液中ρ(PS-NPs)为10000mg·L-1。

　　1.2供试大蒜和培养实验

　　挑选饱满且大小一致的金乡大蒜蒜瓣，先用2%H2O2溶液浸泡约30min，进行表面灭菌，随后用超纯水多次漂洗去除残留H2O2。用吸水纸擦拭干净后，放置于直径12cm的玻璃培养皿中。每盘处理放置12粒蒜瓣，加入20%Hoagland营养液160mL，随后整盘置于光照培养箱(SPX-250B-G，上海博迅)中培养6d，待其茎盘长出短根及顶部冒出细牙后进行胁迫实验。在胁迫实验中，取适量PS-NPs原液，用20%Hoagland营养液稀释，使培养液中ρ(PS-NPs)分别为1、10、50和100mg·L-1，取160mL培养液继续培养。设置培养箱温度为22℃±1℃，光照时间为13h，光照强度约9900lx。培养过程中每日早晚各添加适量纯水补充蒸发量，每3d更换一次培养液。

　　在PS-NPs处理第10d和第20d采集植物叶片后测定。Hoagland营养液[21]成分为5.00mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、5.04mmol·L-1KNO3、1.99mmol·L-1MgSO4·7H2O、1.03mmol·L-1KH2PO4、8.99μmol·L-1Fe2(C4H4O6)3、9.70μmol·L-1H3BO3、2.02μmol·L-1MnCl2·4H2O、0.31μmol·L-1ZnSO4、0.20μmol·L-1CuSO4·5H2O和0.09μmol·L-1H2MoO4·4H2O。取PS-NPs原液时，先超声(120W)振动5min以保证取样均匀。

　　同时培养液中每天早晚补水后适当搅拌，以保证培养液中纳米塑料质量浓度均匀。叶片采集和后处理：先使用去离子水清洗大蒜叶片表面，用吸水纸擦拭干净，然后使用手术剪刀分别剪取大蒜叶片中段。取样完成后迅速完成部分指标测定，其余样本先液氮速冻，然后迅速置于超低温冷冻储存箱(DW-HL100，中科美菱)中保存待测。

　　1.3指标测定方法叶绿素采用丙酮乙醇浸提法测定[22]，超氧化物歧化酶(SOD)采用黄嘌呤氧化酶法测定[23]，过氧化物酶(POD)采用愈创木酚显色法测定[24]，抗坏血酸过氧化物酶(APX)采用紫外分光光度法测定[25]，脯氨酸采用酸性茚三酮显色法测定[26]，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸显色法测定[26]，可溶性蛋白质采用考马斯亮蓝法测定[25]，可溶性糖采用蒽酮比色法测定[25]，维生素C采用比色法测定[25]。以上所有指标均采用试剂盒检测。所有试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，详细实验步骤严格按照说明书进行。

　　1.4数据处理本实验数据均使用SPSS26.0进行单因素ANOVA检验分析，以Duncan检验进行事后多重比较(P<0.05)。实验数据均以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示，图形均采用Origin2018软件绘制。

　　2结果与讨论

　　2.1PS-NPs对叶绿素含量的影响

　　光合作用是植物必需的重要生理过程，能为植物生长和生物量的增加提供重要帮助，叶绿素含量的多少又能直接影响光合作用的强弱[27]。可见，添加PS-NPs处理后，叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量都显著低于对照组(P<0.05)，且都在ρ(PS-NPs)为1mg·L-1处理时出现最低值。Lian等[28]的研究结果表明，在100nm的PS-NPs胁迫下，生菜(LactucasativaL.)叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量皆低于对照，与本研究结果一致。

　　叶绿素的合成是一个由多酶参与的复杂过程[29]，PS-NPs胁迫可能会降低合成关键酶活性，从而使得叶片叶绿素含量下降。本实验中添加PS-NPs处理后，叶绿素含量均随PS-NPs质量浓度的增加而上升，这可能是因为非生物逆境胁迫促使叶片浓缩，从而导致单位面积的叶绿素含量增加[30]，还有可能是在逆境胁迫下，叶绿素与叶绿体蛋白间的结合逐渐松弛，叶绿素更容易被提取，最终导致叶绿素含量增加[31]。

　　2.2PS-NPs对大蒜叶片的氧化损伤

　　SOD作为抗氧化防御的第一道防线，对机体氧化和抗氧化的平衡至关重要[32]。经PS-NPs胁迫处理10d和20d后，SOD活性随PS-NPs质量浓度的增加均呈先升高后降低的趋势，在ρ(PS-NPs)为10mg·L-1时，SOD活性相比对照分别上升了17.98%和7.33%，且差异显著(P<0.05)。当ρ(PS-NPs)增大至100mg·L-1时，第10d和20d处理下，SOD活性相比对照分别降低了13.42%和20.87%，这表明高质量浓度的PS-NPs处理会显著抑制大蒜叶片的SOD活性。

　　PS-NPs对大蒜叶片POD活性的影响。10d处理时，POD活性随PS-NPs质量浓度的增加而上升，在ρ(PS-NPs)为100mg·L-1时，POD活性相比对照上升了138.55%，差异显著(P<0.0520dpodps-npsps-nps50mgl-1100mgl-1pod46.2251.6910dps-npspodpodapxh2o233ps-npsapx2cps-nps10dapx74.33897.17179.937.57ps-nps10dapx20dapxps-nps1mgl-1100mgl-129.1158.44p>0.05)。这表明在本实验PS-NPs质量浓度范围内，PS-NPs胁迫处理20d内不会显著抑制APX活性。

　　脯氨酸是一种可溶性渗透剂，能作为渗透调节介质、自由基清除剂和高分子结构稳定剂来帮助植物抵御外界环境胁迫[34]。PS-NPs对大蒜叶片脯氨酸含量的影响。可见，脯氨酸含量随PS-NPs质量浓度的增加呈先增加后减少的趋势。在ρ(PS-NPs)为10mg·L-1时，10d处理下，叶片脯氨酸含量达到峰值，最高脯氨酸含量相比对照增加了308.27%。而当ρ(PS-NPs)增加至100mg·L-1时，在20d处理下，叶片脯氨酸含量相比对照则减少12.77%。

　　MDA常常反映机体内脂质过氧化程度，也可间接地反映出细胞的氧化损伤程度[26]。经PS-NPs胁迫处理后，大蒜叶片MDA含量随着PS-NPs质量浓度的增加而增加，在ρ(PS-NPs)为100mg·L-1、胁迫处理20d时，MDA含量达到最高，相比对照增加了89.70%。且在同一质量浓度的PS-NPs处理时，胁迫时间越长，MDA含量也越高。这表明随着PS-NPs质量浓度增大和胁迫时间延长，大蒜叶片的脂质过氧化程度和细胞损伤程度在逐渐加重。SOD可清除机体内过量产生的超氧阴离子自由基(O2-·)，使之发生歧化反应，生成H2O2和O2[35]。

　　随后，POD和APX活性也将被激活，催化分解H2O2生成H2O和O2[36]。Zhou等[37]的研究表明，在粒径20nm的PS-NPs作用下，水稻根系SOD活性随着PS-NPs质量浓度的增加而上升，与本实验中ρ(PS-NPs)≤10mg·L-1处理10d时的结果较一致。同时，本实验结果显示，经ρ(PS-NPs)为100mg·L-1胁迫处理后，大蒜叶片的SOD活性被显著抑制，这可能是由于产生的过量自由基已超过酶作用阈值[37]，且生成的过量H2O2也会抑制SOD活性[38]。

　　此外，在ρ(PS-NPs)为100mg·L-1时，10d后大蒜叶片的POD和APX活性均高于对照，这可能是因为氧化胁迫增强，植物体通过提高这两种酶活性使自身免受伤害[25];但20d后两者活性都受到抑制，这可能是由于H2O2的积累速度大于植物保护系统清除的速度，造成H2O2过度积累，从而导致酶活性出现抑制现象[39]。NPs具有显著诱导APX酶基因表达的能力[40]，如在粒径为100nm的PS-NPs胁迫下，黄瓜(CucumissativusL.)叶片APX酶基因相对表达水平提高了600%以上[25]。

　　本实验中，在ρ(PS-NPs)为10mg·L-1时，10d胁迫下APX活性达到最大，推测可能是此时PS-NPs诱导的APX酶基因表达量显著增加，从而使得APX活性显著上升。本实验中脯氨酸含量总体呈现先增大后减小的趋势，这表明在一定PS-NPs质量浓度胁迫时，大蒜体内的脯氨酸能作为有效的抗氧化剂清除自由基，调节大蒜体内的氧化平衡状态。从MDA含量变化来看，由于抗氧化酶活性在ρ(PS-NPs)为100mg·L-1、胁迫处理20d时都被抑制，导致机体内脂质过氧化程度显著上升，即MDA含量显著增加(P<0.05)，这也间接反映出高质量浓度PS-NPs的存在可对大蒜造成氧化损伤[41]。

　　2.3PS-NPs对大蒜叶片营养品质的影响

　　蛋白质、糖类和维生素等是植物体内重要的营养素，其含量的多少也可直接或间接反映出植物营养品质的高低[42]。PS-NPs胁迫下大蒜叶片可溶性蛋白质含量，经PS-NPs处理10d后，当ρ(PS-NPs)≤50mg·L-1时大蒜叶片可溶性蛋白质含量略低于对照，但当ρ(PS-NPs)增加至100mg·L-1时，可溶性蛋白质含量较对照增加9.45%。

　　在PS-NPs胁迫处理20d后，大蒜叶片可溶性蛋白质含量均高于对照，但增加均不显著(>0.05)。可溶性糖含量在ρ(PS-NPs)为10mg·L-1和50mg·L-1时均显著低于对照，PS-NPs的存在降低了大蒜叶片可溶性糖含量，表现出抑制作用;但在ρ(PS-NPs)为100mg·L-1时，处理10d和20d后，可溶性糖含量相比对照分别升高了2.50%和44.65%，表现出促进作用。

　　10d处理时，PS-NPs胁迫使得维生素C含量显著增加。但20d处理时，维生素C含量呈先上升后下降的趋势，并在ρ(PS-NPs)≥10mg·L-1时开始低于对照。当ρ(PS-NPs)增加至100mg·L-1时，维生素C含量较对照降低26.53%，达到差异显著水平(<0.054344l.sativaps-npslian28ps-nps1mgl-1l.sativaps-nps1mgl-110d>0.05)，而此时可溶性糖含量要显著高于对照，这可能是可溶性糖含量的增加缓解了PS-NPs的胁迫，进而可溶性蛋白质含量并未发生显著变化[45]。

　　维生素C具有清除体内自由基、预防癌症的作用，还有增强人体免疫功能、预防和治疗缺铁性贫血等多种功能，同时，维生素C作为植物抗氧化系统中的非酶性物质，对于抵御外界的非生物胁迫具有重要作用[46]。本研究中，10d处理时维生素C含量显著增加，表明此时维生素C参与了缓解PS-NPs带来的胁迫效应。在ρ(PS-NPs)为100mg·L-1时，20d胁迫使得维生素C含量显著下降，可能是高氧化胁迫环境造成维生素C合成量下降，也可能是清除体内过量的自由基需要消耗大量的维生素C，消耗量大于合成量所致[47]。

　　3结论

　　(1)在粒径为80nm的PS-NPs胁迫下，大蒜叶片的光合色素(叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素)含量均显著低于对照，表明80nm的PS-NPs能显著影响金乡大蒜叶片叶绿素的合成过程。(2)80nm的PS-NPs能对大蒜叶片造成氧化胁迫，植物则可以通过提高SOD、POD、APX酶活性和脯氨酸含量来缓解一定程度的氧化胁迫环境。(3)80nm的PS-NPs对大蒜叶片可溶性蛋白质含量的影响不显著，对可溶性糖、维生素C含量的影响和PS-NPs质量浓度、胁迫时间有关，纳米塑料对大蒜叶片营养品质的影响还需进一步研究。

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　　作者：邱陈陈1，李国新1*，李青松1，颜昌宙2