番茄不同生态位内生菌的菌群结构组成和差异性分析

《番茄不同生态位内生菌的菌群结构组成和差异性分析》论文发表期刊：《基因组学与应用生物学》；发表周期：2020年12期

《番茄不同生态位内生菌的菌群结构组成和差异性分析》论文作者信息：张婷负责实验实施和论文撰写；田宝玉、许小红、蓝灿华负责实验设计指导和论文修改：张婷负责数据处理分析；黎烨和熊娟负责文献查阅及实验辅助。全体作者都阅读并同意最终的文本。

　　摘要 植物内生菌与其宿主在长期进化过程中形成一种共生或互生的关系，对植物的生长发育、病虫害防治、植物抗性、生物修复等方面都具有积极的作用。为了解植物不同生态位内生菌菌群组成和形成机制，本研究以番茄为材料，通过高通量测序解析番茄植株根、茎和叶3个不同生态位内生菌菌群组成与结构差异。收集番茄根、茎、叶组织样品分别消毒，并分别进行研磨破碎提取基因组DNA，检验合格后送交公司进行16S rDNA序列V5-V7可变区的Illumina Miseq测序和微生物多样性分析。结果表明，植物植株内不同生态位内生细菌菌群结构组成和多样性有一定的差异。其中，根内生菌优势菌群主要由Proteobacteria，Actinobacteria，Firmicutes等组成;茎的优势菌群包括Proteobacteria和Firmicutes等;而叶的优势菌群主要由Proteobacteria等组成。Proteobacteria是番茄根、茎、叶中共有的主要优势内生菌群，但其在3个不同生态位中所占比例大小明显不同。根内生菌具有更高的种群多样性，且与茎和叶相比具有明显的差异性。总体来讲，根和茎内生菌组成和多样性相似度更高，Venn图分析表明根和茎有更多的共有OTU，而根和叶都有较多的特有OTU，表明茎的菌群受根的影响较大，而根和叶的菌群组成有较高的独立性。

　　关键词 生态位，植物内生菌，菌群多样性，细菌定殖，高通量测序

　　Abstract Plant endophyte, which plays a positive role in plant growth and development, pest control, plant resistance, bioremediation and other aspects, has formed a symbiotic or symbiotic relationship with their host in the long-term evolution process, In this paper, to understand movement of endophyts in plant tissues and their assembly mechanism of endophytic flora, the composition and structure of bacterial endophytic flora of tomato in different parts, roots, stems and leaves were analyzed by using the high-throughput sequencing method. The samples for tomato root, stem and leaf were separately collected and disinfected. The processed samples were ground and broken to extract their genomic DNA. The extracted genomic DNA samples were sent to the company for amplifying the V5-V7 region of bacterial 16S rDNA and Illumina Miseq sequencing. The results showed that the plant tissues hadcertain effects on community structure and bacterial diversity of plant endophytic microbiome. Among them, Proteobacteria was the predominant microflora of endophytes of tomato, and it is the main dominant microflora shared by roots, stems and leaves. However, the proportions of Proteobacteria were obviously different in three different ecological niches. In addition, Actinobacteria and Firmicutes in tomato root, and Firmicutes in stem, were also among the dominant microflora. Root endophytes had higher population diversity and were obviously different from stem and leaf microbiome. In general, the composition and diversity of endophytic bacteria of roots and stems were more similar. Venn diagram analysis showed that roots and stems share more OTU, while roots and leaves have more unique OUT, suggesting the stem flora was greatly influenced by root, while the composition of root and leaf flora was relatively independent

　　Keywords Endophytic bacteria, Ecological niche, Community diversity, High throughput sequencing

　　内生菌(Endophytes)一词最早起源自希腊语"endon"，指在生命周期的一定阶段或整个生命周期都定殖在植物组织或器官的细菌或真菌，与宿主形成微生物共生体且对宿主植物几乎不存在有害影响(Kandel et al，2017)。在地球上存在的近30万种植物物种中，几乎所有的植物都有一种或多种内生菌(Ryan et al，2008)，植物内生菌在植物组织中定殖，并且能够与入侵者(如病原体)相互作用，对植物的生长发育、病虫害防治、植物抗性、生物修复等方面都具有积极的作用(吴彩兰，2016)，例如具有内生菌的共生植物不仅能够缓解压力，而且还能显著提高植物的产量和高度

　　(Rojas-Tapias et al.，2012;Ali et al.，2014;Naveed et al.，2014;Qin et al.，2014;Yaish et al.，2015)。一些土壤细菌与非豆科植物发生内生关联(Lupwayi et al，2004)，可能对宿主植物产生营养供给，如在许多不同的植物中发现了Azoarc us，Burkholderia.Gluconobacter.Her--baspirillum、Klebsiella，Pantoea，Rahnella等几个属的细菌内生菌，能够促进宿主植物在营养不良条件下稳定的生长(Reinhold et al.，1987;Riggs et al.，2001;RosenbluethMartinez-Romero，2006;Doty et al，2009)。许多植物内生菌可以通过合成生长素，如吲哚乙酸(IAA)生产活性，1-氨基环丙烷-1-羧酸盐(ACC)脱氨酶活性等促进植物生长。

　　内生菌在植物内的定殖与发展受到多种因素的影响，如温度，湿度，土壤微生物菌，植物生长周期等这些都会影响内生菌在植物体内的分布与丰度。研究表明内生菌在植物中的定殖主要依靠于渗透作用(Compant et al.，2010)，随着hh的出E植物生长 t开始，根系和土壤微生物群落之间开始相互作用，土壤内的微生物首先附着在根周围形成根际细菌，根际细菌再依靠分泌细胞壁溶解酶或脂多糖、诱导根瘤菌形成结瘤基因、依靠鞭毛或菌毛运动等一个或多个条件，从根部的裂缝处渗透进入，进而通过一系列生命活动定殖在根的内部形成内生菌。例如许多细胞内植物-微生物相互作用的情况就始于微生物通过细胞内接近根毛的定殖。豆科植物-根瘤菌共生体中就是这种情况，根毛为这些内生菌提供了合理的入口点。研究也表明在内生菌定殖的早期阶段，首先在根毛中观察到内生菌，然后在根皮层中观察到内生菌(Prieto et al.，2011;Castanheira et al.，2017;Rangjaroen et al.，2017)。

　　内生菌并不单单只存在于植物根部，伴随着纤维素分解酶合成，以及细菌细胞的移动性，都有助于内生菌扩散到包括叶和茎的其他植物部分(Santi et al.，2013)，而对植物不同部位微生物组成和多样性的研究也表明内生菌广泛存在于植物组织和细胞间隙，包括根、茎、叶、花和种子(Iniguez et al.，2004;Compant et al.，2005;Kandel et al.，2015)。使用绿色荧光蛋白

　　(GFP)标记和GUS染色，在葡萄藤植物的接种叶的木质部和亚气室中观察到伯克霍尔德菌菌株PSN，在葡萄叶中也观察到通过气孔孔径离开的细菌细胞(Compant et al.，2005)。通过荧光原位杂交(FISH)和共聚焦激光扫描显微镜观察了葡萄叶片不同部分中的细菌内生菌的生态位。在叶脉，毛状体和叶片的切片中观察到细菌菌落(Piccolo et al.，2010)。在研究拟南芥叶和根源微生物群中发现，在叶和根微生物群之间具有广泛的分类学重叠，其基因组编码的功能基因大量重叠，在各个功能类别的水平上几乎没有显着差异，说明根际与植物其它植物组织的微生物群体结构组成及其功能是相互影响的(Baiet al，2015)。

　　早前关于人体微生物组的研究表明，身体不同部位微生物的结构组成和多样性明显不同，认为人体微生物组的结构和组成主要由其所处的生态位所决定

　　(Ottesen et all，2013)。从整体上来说，生态位的不同决定了菌群的结构组成。不同生态位的微生物群体与植物组织在长期进化过程中互惠互利，在植物抗逆性，对干旱、炎热和盐胁迫的耐受性以及对病原菌的抗性中发挥巨大作用。但是目前关于内生菌定植过程中在空间维度上的移动的机制还不是很成熟，所以需要在知道其不同生态位的菌群构成的基础上利用FISH技术再加以探索。同时，这些结果也表明，我们的微生物群虽然是个性化的，但在不同的身体栖息地和时间内系统地变化着，这样的趋势可能最终揭示微生物群的变化是如何导致或预防疾病的。

　　本研究以番茄为对象，分别收集并提取植物根、茎、叶3个不同部分基因组，扩增细菌16S rRNA基因的V5-V7可变区，再通过Ilumina Miseq高通量测序平台对细菌菌群的结构组成和多样性进行测序和分析，以期解析植物不同生态位微生物群落结构组成的差异和共性，理解植物内生菌群落结构的形成机制及细菌在植物组织内的迁移规律，为维持健康植物微生物组，以及通过引入和干预益生微生物在植物体内的建成促进植物健康提供科学依据。

　　1结果与分析

　　1.1数据的处理和统计

　　通过高通量测序，番茄的根、茎、叶3个样品分别测到61 905，63 784.48039条原始序列。再经过去除引物接头序列、质控过滤、去除嵌合体及非特异性扩增序列、去除线粒体叶绿体等操作后根茎叶最终分别得到57 925、62 471、40451条有效的高质量序列。

　　为了保证结果的均一性，进而对这些有效序列按最少序列数目进行抽平处理。

　　1.2番茄根茎叶细菌群落结构组成分析通过将样品的OTU代表序列与SILVA数据库进行比对，绘制出样本的柱状丰度图，能够更加直观的分析出样本间物种构成及比例，以门的水平为例

　　(图1)，根的内生菌菌群主要由放线菌门Actinobacteria(44.76%)、变形杆菌门Proteobacteria(42.38%)、厚壁菌门Firmicutes(11.39%)组成，其次是少量的拟杆菌Bacteroidetes(1.08%)等。茎的内生菌菌群主要由变形杆菌门Proteobacteria(93.24%)、厚壁菌门Firmi cutes(6.42%)组成。叶的内生菌菌群主要由变形杆菌门Proteobacteria(99.19%)组成。结果表明，在门的水平上根茎叶的的内生菌菌群的组成成分与丰度具有明显的差异，不仅是在门的水平上具有明显差异，在较低水平例如目水平的优势菌群也存在较大差异。在目的水平上(图2)，根的内生菌优势菌群主要包括放线菌目Actinomycetales(43.32%)、根瘤菌目Rhizobiales

　　(23.47%)、肠杆菌目Enterobacteriales(14.42%)、芽孢杆菌目Bacillales(10.25%)以及少量的伯克氏菌目Burkholderiales(1.34%)、鞘脂单胞菌目Sphingomonadales(1.27%)。茎的内生菌优势菌群主要包括肠杆菌目Enterobacteriales(69.92%)、黄色单胞菌目Xanthomonadales(14.91%)、以及少量的芽孢杆菌目Bacillales(6.38%)、伯克氏菌目Burkholderiales(3.82%)、假单胞菌目Pseudomonadales(3.12%)，叶的内生菌优势菌群主要包括海洋螺菌Oceanospirillales(53.83%)、肠杆菌目Enterobacteriales(32.42%)以及少量的立克次体目Rickettsiales(9.91%)、伯克氏菌目Burkholderiales(1.59%)。结果证明不同生态位的菌群结构组成与菌群多样性具有明显的差异性。

　　Heatmap可以用颜色变化来反映物种分布的丰度信息，图中每一列代表一个样本，每一行代表不同的物种组成，颜色块代表物种的相对丰度值，颜色越红表示相对丰度越高，颜色越蓝则代表相对丰度越低。如图所示(图3)，在属的水平上，取相对丰度较高的前50个属绘制物种Heatmap图旨在能够清晰展示各物种组成与丰度之间的差异。结果如图所示，根的优势菌属主要由苍白杆菌属Ochrobactrum(17.51%)肠杆菌属Enterobacter(13.39%)、伦茨氏菌属Lentzea(10.09%)、北里孢菌属Kitasatospora(9.3%)、糖霉菌属Glycomyces(7.11%)、芽孢杆菌属Bacillus(6.17%)以及少量的申氏杆菌属Shinella(1.71%)、游动放线菌属Actinoplanes(1.45%)、韩国生工属Kribbella(1.34%)和类诺卡氏属Nocardioides(1.24%)组成。茎的优势菌属主要由肠杆菌属Enterobacter(65.58%)、寡养单胞菌Stenotrophomonas(14.73%)以及少量的芽孢杆菌属Bacillus(5.57%)、劳尔氏菌属Ralstonia(3.75%)假单胞菌属Pseudomonas(1.82%)和不动杆菌属Acinetobacter(1.21%)构成。叶的优势菌属主要由Nitrincola

　　(53.13%)、立克次体属Rickettsia(9.71%)、杀雄菌属Arsenophonus(2.05%)和劳尔氏菌属Ralstonia组成(1.38%)。其中苍白杆菌属、伦茨氏菌属、北里孢菌属、糖霉菌属仅大量存在于根中。寡养单胞菌、假单胞菌属、不动杆菌属仅存在于茎中。Nitrincola、立克次体属、杀雄菌属仅存在于叶中。肠杆菌属和劳尔氏菌属在根茎叶中都存在，但是所占的比例有较大的区别。因此可以推断出不同生态位对菌群的组成和丰度具有明显的影响，且根的菌群多样性明显较茎和叶高。从样本聚类树图叶也可以看出其中根和茎的亲缘关系较叶相比相对接近。

　　从OTU分布的韦恩图显示相同的结果(图4)(不同颜色代表不同样品，图中数字代表特异或共有的

　　OTU数)。为了保证差异的明显性和准确性，选用根茎叶中OTU总数大于5的序列绘制Veen图，旨在说明不同生态位的组成差异性和亲缘关系的差异。经统计，这些OTU隶属于5个门，174个属，其中根和茎的共有OTU数为94，根和叶的共有OTU数为72，茎和叶的共有OTU数为40，结果表明，根与茎的亲缘关系较叶相比相对较近，茎的菌群受根的影响较大，而叶的菌群可能受外界影响较大，例如菌群可能从叶片进入。除此之外，根的特有OTU数为367，茎的特有OTU数为51，叶的特有OTU数为44，因此可推断出根的菌群可能受外界影响较大，例如土壤内环境。且多样性与丰富度较茎和叶相比较高。

　　1.3番茄根茎叶样品内生菌Alpha多样性分析Alpha多样性指数主要包括Chaol指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数、Coverage(测序深度指数)等，能够反映菌群微生物的物种丰富度和多样性。其中Chao1指数和ACE指数评估群落微生物的物种丰富度，指数越高则丰富度越高。Shannon指数和Simpson指数评估菌群微生物的物种多样性，其中Simpson指数越高则群落多样性越低，Shannon指数越高则群落多样性越高。根茎叶的菌群多样性分析结果(表1)。

　　结果显示，根茎叶的Coverage指数均达到90%以上，达到测序深度，说明结果具有良好的置信水平。根的OTU指数高达4533，而茎和叶的OTU分别为2996和1925，并且植株根的Simpson指数明显低于茎和叶，Shannon指数明显高于茎和叶，因此可推断出根的菌群多样性较高且与茎和叶相比具有明显的差异性。此外植株叶的Chao1指数和ACE指数也明显低于根和茎，说明叶的菌群丰富度明显低于根和茎。

　　1.4番茄根茎叶样品内生菌Beta多样性分析

　　根据主坐标分析图来评估番茄根茎叶的细菌菌群结构的Beta多样性，可以直观的显示出番茄根茎

　　叶3个位置的菌群差异性(图6)，图中代表根茎叶的3个点分布相互间隔很远，说明根茎叶的菌群组成具有较大的差异性。在R的vegan package的分析下基于OTU的样本所做的聚类树图显示同样的结果，如图(图5)所示，将根茎叶3个部位的序列进行比对分析，结果表明根和茎聚为一枝，相对距离较近，叶单独为一枝，即根和茎的亲缘关系相对较近且与叶的亲缘关系相对较远，进一步验证茎的菌群受根的影响较大。

　　2讨论

　　内生细菌存在于植物的特定组织中，通过营养物质、酶(脂肪酶，过氧化氢酶，氧化酶等)、功能因子(铁团，生物表面活性剂等)的交换以及信号的传递(Parsek and Greenberg，2000;Hardoim et al.，2015)，与植物之间相互作用。它们长期定殖于植物组织中，基本不会产生类似病原体的负面影响，如破坏呼吸作用、光合作用，营养物质的转移、蒸腾等。相反，宿主植物中这些内生细菌的存在对其健康和生长的具有有益影响。

　　目前，在己研究植物的各个部位和器官如根、茎、叶、果实、种子、胚中均能分离到内生细菌，在番茄根内注释到放线菌、变形杆菌、拟杆菌门、TM7、酸杆菌和Gemmatimonadetes的存在(Tian et al，2015)。

　　并且内生细菌的结构组成及丰度会随着不同的植物品种、部位、不同的发育时期的变化而发生相应的改变。例如，王美琴等(2010)对番茄内生细菌结构组成研究时发现不同生长地的番茄内生菌的结构组成与丰度存在差异;不同组织中也有差异，其中根是细菌的主要来源数量最多，生态位越高数量相对减少，因此茎、叶次之;不同发育期如拨苗期到开花期内生菌种类和丰度增多，而近邻成熟期时其优势菌群的比例会发生变化。除此之外，吴彩兰(2016)对加工番茄的研究也显示同样的结果，例如在根茎叶及其果实中分离得到的菌的种类数量有一定差距，其在根中分离得到97株菌，茎分离得到79株菌，叶分离得到65株菌以及果实分离得到44株菌，经分子生物学鉴定主要包括芽孢杆菌属、假单孢菌属、黄单孢菌属、土壤杆菌属、欧氏杆菌属、肠杆菌属。其中芽孢杆菌和假单胞杆菌是分离频率最高，数量相对最多，属于优势菌群，且可以通过间接方式促进植物生长，抑制病原微生物的生长而促进植物健康，减轻作物的干旱，热和盐胁迫等。

　　最近有研究强调了微生物和宿主相互作用对食用和药用植物生长、质量和健康的重要性，番茄植株作为一个重要的农产品之一其细菌群落组成对植株健康的影响也是一个可研究的课题(Abbamondi et al，，2016)，本试验以番茄为例，利用高通量测序速度快，通量高，准确率高等特点，在Ilumina Miseq高通量测序平台，对各部位细菌16S rDNA的Vs-V7区进行扩增测序，进而通过序列合并，质控过滤，聚类分析，多样性分析等过程对番茄不同生态位的内生细菌的菌群结构组成与多样性进行分析。通过结构组成Heatmap图分析可得根主要由苍白杆菌属、肠杆菌属、伦茨氏菌属、北里孢菌属、糖霉菌属、芽孢杆菌属组成。茎主要由肠杆菌属、寡养单胞菌、芽孢杆菌属构成。叶的优势菌属主要由Nitrincola、立克次体属、杀雄菌属和劳尔氏菌属组成。其中肠杆菌属，芽孢杆菌属在根和茎中同时存在且占比例相对较大，因此可推测其发生迁移。再通过Alpha多样性分析的各个指数可更加明确判断菌群的差异性。其中根的Shannon指数4.25.Simp-

　　sons指数0.06，茎的Shannon指数1.81，Simpsons指数

　　0.45，叶的Shannon指数1.81，Simpsons指数0.35，根的菌群多样性明显高于茎和叶。除此之外根的菌群丰富度(Chao 1指数23 975，ACE指数55 132)与茎的菌群丰富度(Chao 1指数29 786，ACE指数82 907)差异不明显，但与叶的菌群丰富度(Chao 1指数12 858，ACE指数44 206)差异较大。因此可明显推断出不同的植物生态位对植物细菌结构组成多样性和丰富度有一定程度的影响。除此之外，经过对其中OTU组成进行分析发现根和茎的共有OTU数为94，根和叶的共有OTU数为72，茎和叶的共有OTU数为40，结果表明，根与茎的亲缘关系较叶相比相对较近，茎的菌群受根的影响较大，而叶的菌群可能受外界影响较大，例如菌群可能从叶片进入。而且根的特有OTU数为367，茎的特有OTU数为51，叶的特有OTU数为44，因此可推断出根的菌群可能受外界影响较大，例如土壤内环境。且多样性与丰富度较茎和叶相比较高我们通过对不同生态位菌群的研究，发现不同生态位菌群的组成和丰富度具有很大的差异性，可进行进一步推测验证是生态位决定了菌群的组成。除此之外利用各自的优势菌群与共同的菌群，推测可能菌群的迁移，后期再利用定位技术加以辅助即可对其在植物内的移动机制有更深层次的探索。为维持健康植物微生物组，以及对引入有益微生物在植物体内的建成和促进植物健康提供理论基础。

　　3材料与方法

　　3.1试验材料

　　实验番茄种植于福建师范大学旗山校区试验田。选取生长状况良好，苗期为3个月的健康番茄植株，小心将番茄根部，茎部和叶的浮土用无菌水冲洗干净，并且将处理后的番茄样品放入4℃冰箱保存并及时处理。

　　3.2番茄根、茎、叶等部位消毒及其基因组总DNA的提取

　　先对番茄植株进行消毒：取其根，茎，叶等部位的样品，先采用无菌水充分冲洗浸渍以后，使用5%次氯酸钠溶液将其浸渍1 min，浸渍过后用无菌水进行清洁，第二步使用75%乙醇浸渍3 min以后，用无菌将其水冲刷清洁。再对消毒情况进行检测：预先取出少量植物根、茎、叶3部分的组织样品分别放置于无菌的LB平板，于恒温箱37℃无菌过夜培养，若无杂菌生长，说明组织样品消毒彻底(Cao et al，2015;雷少楠等，2017)。后进行基因组DNA的提取：分别选取3种组织样品用无菌的剪刀剪碎后放入无菌离心管中，同时加入灭菌的石英砂用组织研磨棒进行研磨，研磨完成后使用土壤基因组DNA提取试剂盒对番茄根，茎，叶等组织的总基因组DNA提取。提取所得DNA样品用超微量分光光度计进行纯度检测，合格后置于-20℃冰箱存储。

　　3.3细菌16S rDNA PCR扩增及高通量测序以提取的DNA为模板，27F和1492R这两个细菌16S rDNA通用引物来聚合酶链式反应扩增。PCR扩增反应的基本条件：94℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸90 s，设定30个循环。反应体系为50LL，每个反应添加2 L的DNA模板，PCR反应后用电泳检测浓度，琼脂糖浓度采用1%。电泳后对结果进行观察发现约1500 bp明亮条带，证明扩增出细菌16S rRNA基因，将获得的总基因组DNA进行Illumina Miseq高通量测序(雷少楠等，2017)。

　　模板选用上述基因组DNA，细菌16S rDNA的V5-V7区引物F:AACMGGATTAGATACCCKG和R：ACGTCATCCCCACCTTCC及融合barcode(Bai et al.，2015)、测序引物、接头序列的引物对各样本的V5-V7区进行聚合酶链式反应扩增后等量混合，用于进行高通量测序。测序采用Ilumnia MiSeq测序平台，选取PE 2x250 bp测序策略。两轮测序，一轮测序初步去除叶绿体的所有序列，第二轮补测细菌序列少于4000 reads的样品，担保有充足数目的细菌DNA后续分析。

　　3.4数据处理

　　高通量测序获得原始数据首先采用FLASH软件对成对的短读取序列(reads)进行拼接(Compant et al.，2005;Piccolo et al，2010;Chen et al.，2013)，拼接后利用Cutadapt软件去除Barcode和引物序列。接下来使用Usearch软件删除低质量的序列(模糊识别碱基，引物错配，读长异常的序列)(Edgar，2010)。初步质控过滤之后的序列采用de novo方法进行嵌合体序列检查和去除(Edgar et al，2011;Haas et al.，2011;Quince et al.，2011)，最终得到用于聚类和分类分析的高质量有效序列。

　　利用Usearch平台对得到的高质量有效序列进行聚类分析，将序列相似度>97%的序列命名为一个操作分类单元(OTU)，选取每类中最长的序列作为OTU代表序列，使用RDP Classifier的方法与SILVA数据库进行比对注释，进而得到每个OTU的物种分类学信息(王少果等，2015)，根据获得的OTU分类信息，删除样品中植物叶绿体(Chloroplast)和线粒体(Mitochondria)的OTU，由于不同样本对应的序列数量差距较大，为了保证结果的均一性，需要对每个样品按最小的序列数进行随机抽平处理。抽平后，从新进行OTU聚类和分类分析，生成OTU表，以备后续数据分析。

　　3.5数据分析

　　利用得到的OTU的分类信息，运用R语言gplots(version 2.17.0)软件包绘制各个样品结构组成柱状图以及可视化的热点图(Heatmap)，QIME脚本用于计算分类序列的百分比，以及在OTU的相似度在97%以上的标识上绘制Rank abundance曲线来反映物种组成的均匀度与丰富度。利用QIME做rar-

　　efaction分析，利用R制作曲线图，用Chaol多样性、ACE指数、Shannon和Simpson指数来分析样本的Alpha多样性。采用QIME进行主成分分析(principal component analysis，PCoA)和层次聚类分析来评估样本的B多样性以及不同样本群落组成相似性和差异性。

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