鸟分枝杆菌MAV-2052蛋白的生物信息学分析

《鸟分枝杆菌MAV-2052蛋白的生物信息学分析》论文发表期刊：《中国病原生物学杂志》；发表周期：2021年02期

《鸟分枝杆菌MAV-2052蛋白的生物信息学分析》论文作者信息：高婧华(1990-)，女，云南人，在读硕士研究生。主要研究方向：非结核分枝杆菌的感染与免疫。

　　【摘要】目的 应用生物信息学分析软件预测鸟分枝杆菌MAV-2052蛋白的结构和功能。方法 利用在线uniprot蛋白数据库、ProtParam蛋白分析网站、在线Protcale，TMHMM(TMHMM Server V 2.0)和SignalP 5.0，Softberry和PSORTII Server，以及SOPMA和SWISS-MODEL等生物信息学预测软件对MAV-2052蛋白的理化性质、疏水性分析、信号肽、跨膜区、亚细胞定位及二级结构进行分析预测并对其三级结构进行模型构建;对蛋白磷酸化位点进行预测，运用uniprot蛋白数据库的Blast工具对氨基酸进行比对，采用MEGA-X软件构建进化树。结果 MAV-2052基因全长933 bp，编码310个氨基酸的蛋白质。该蛋白与鸟分枝杆菌亚型起源于同一物种，与结核分枝杆菌的半胱氨酸合酶k，同源性较高。MAV-2052为稳定的疏水性蛋白，无跨膜区、无信号肽;预测该蛋白亚细胞定位在细胞质中，蛋白序列中存在13个丝氨酸磷酸化位点，二级结构以r螺旋为主且有两个结构域;三级结构模型显示该蛋白可形成同源二聚体，但无其他配体结合空间位置。MAV-2052蛋白为半胱氨酸合酶，属于半胱氨酸合酶/半胱氨酸3合成酶家族，是调控鸟分枝杆菌生长中的重要蛋白之一。结论 生物信息学预测鸟分枝杆菌MAV-2052为半胱氨酸合成酶，是调控细菌生长的重要蛋白，可为鸟分枝杆菌的靶向治疗提供新思路

　　【关键词】鸟分枝杆菌;结构;功能;生物信息学分析

　　[ Abstract] Objective To use bioinformatic analysis software to predict the structure and function of the Mycobacteri um avium mav-2052 protein Methods The uniprot database online, the protein analysis website ProtParam, ProtScale online. TMHMM (TMHMM Server V 2.0). Softberrv. SienalP 5.0. PSORT II Server, SOPMA, and SWISS-MOD-El were used to predict biological information such as the physical and chemical properties and hydrophobicity of the mav-2052 protein, to analyze its signal peptides, transmembrane regions, and subcellular localization, to predict its sec ondary structure, and to model its tertiary structure. The website was used to predict the protein's phosphorylation sites, the Blast tool of the uniprot protein database was used to compare amino acids, and the software MEGA-X was used to construct an evolutionary tree. Results mav-2052 is a protein encoding 310 amino acids. It originates from the same species as M. avium subtypes and has is highly similar to cysteine svnthase K1 of M. tuberculosis. mav-2052 is a stable hydrophobic protein with no transmembrane regions and no signal peptides. The protein is predicted to be located in the cytoplasm, and there are 13 serine phosphorylation sites in the protein sequence. The protein's secondary structure is dominated by alpha helices and it has two domains. mav-2052 is a cysteine synthase that belongs to the cysteine synthase/cysteine beta synthase family, and it is an important protein for regulation of the growth of M. avium. Conclusion Bioinformatics predicted that the M. avium mav-2052 protein is a cysteine synthase. This protein plays an important role in regulating the growth of M. avium. These findings may provide new insights in targeted therapy for M. avium

　　[ Key words] Mycobacterium avium; structure; function: bioinformatic analysis

　　鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium，MAV)属于细胞内寄生菌，是非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)中的一种[1]。研究表明，在健康人中也能建立慢性MAV感染，且多种抗分枝杆菌的药物治疗效果不佳，即使延长18~24个月的疗程也无法将其彻底清除[2);另一方面，MAV的感染在免疫系统受损的个体中引起NTM感染事件越来越多，且尚未制定出有效根除MAV感染的药物治疗方案和预防MAV感染的疫苗[2]，因此，研发有效的抗MAV的药物及疫苗是当务之急.MAV-2052是参与MAV致病的重要蛋白之一，其主要功能是调节宿主细胞氧化与抗氧化的平衡和影响1-半胱氨酸的生成。为进一步了解MAV-2052的结构和功能，本研究从蛋白序列查询、理化性质、多序列对比、疏水性分析、跨膜结构、信号肽分析和亚细胞定位等对MAV-2052蛋白进行生物信息预测和分析。

　　材料与方法

　　1数据资料的获取

　　通过美国国家生物技术信息中心NCB数据库对MAV-2052进行序列分析;登陆Uniprot蛋白数据库和NCBI网站，获取MAV菌株MAV-2052蛋白的基因序列和氨基酸序列。鸟型分枝杆菌亚种(M.avium subsp)、海德堡分枝杆菌(M.heidelbergense)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、新宿分枝杆菌(M.shinjukuense)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)核苷酸序列和氨基酸序列也同样从Uniprot蛋白数据库和NCB网站获取。

　　2生物信息学分析

　　运用在线uniprot蛋白数据库的Blast工具，将MAV-2052基因序列与同源性较高的核苷酸进行比对;比对后的氨基酸运用MEGA-X构建进化树;登录在线ProtParam蛋白分析网站对MAV-2052蛋白进行理化性质分析;运用Protcale对蛋白进行疏水性分析;运用TMHMM(TMHMM Server V 2.0)和Sig-

　　nalP 5.0对MAV-2052进行跨膜和信号肽预测;运用Softberry和PSORT Il Sserver对MAV-2052细胞定位分析;利用SOPMA和SWISS-MODEL对MAV-2052蛋白进行二、三级结构预测;对蛋白磷酸化位点进行预测。

　　结果

　　1 MAV-2052基因的特征

　　GenBank 中MAV-2052基因的登录号为ABK67788.1，基因又名：Cysk，基因序列全长933 bp，编码310个氨基酸的蛋白质。

　　2 MAV-2052蛋白的同源性预测和进化树构建

　　经氨基酸序列比对，鸟型分枝杆菌亚种(Mycobacterium avium subsp)、海德堡分枝杆菌、结核分枝杆菌、新宿分枝杆菌、嗜血分枝杆菌与MAV 104菌株MAV-2052蛋白的序列覆盖区域分别是：100%、91%，88.4%，86.5%和84.8%。多重序列比对分析显示，以上物种氨基酸之间的序列相似度较高(图1)用MEGA-X软件构建系统进化树，结果见图2。鸟型分枝杆菌亚种与MAV起源于同一物种，同源性较高。

　　鸟分枝杆菌MAV-2052蛋白的生物信息学分析

　　高婧华(1990-)，女，云南人，在读硕士研究生。主要研究方向：非结核分枝杆菌的感染与免疫。

　　【摘要】目的 应用生物信息学分析软件预测鸟分枝杆菌MAV-2052蛋白的结构和功能。方法 利用在线uniprot蛋白数据库、ProtParam蛋白分析网站、在线Protcale，TMHMM(TMHMM Server V 2.0)和SignalP 5.0，Softberry和PSORTII Server，以及SOPMA和SWISS-MODEL等生物信息学预测软件对MAV-2052蛋白的理化性质、疏水性分析、信号肽、跨膜区、亚细胞定位及二级结构进行分析预测并对其三级结构进行模型构建;对蛋白磷酸化位点进行预测，运用uniprot蛋白数据库的Blast工具对氨基酸进行比对，采用MEGA-X软件构建进化树。结果 MAV-2052基因全长933 bp，编码310个氨基酸的蛋白质。该蛋白与鸟分枝杆菌亚型起源于同一物种，与结核分枝杆菌的半胱氨酸合酶k，同源性较高。MAV-2052为稳定的疏水性蛋白，无跨膜区、无信号肽;预测该蛋白亚细胞定位在细胞质中，蛋白序列中存在13个丝氨酸磷酸化位点，二级结构以r螺旋为主且有两个结构域;三级结构模型显示该蛋白可形成同源二聚体，但无其他配体结合空间位置。MAV-2052蛋白为半胱氨酸合酶，属于半胱氨酸合酶/半胱氨酸3合成酶家族，是调控鸟分枝杆菌生长中的重要蛋白之一。结论 生物信息学预测鸟分枝杆菌MAV-2052为半胱氨酸合成酶，是调控细菌生长的重要蛋白，可为鸟分枝杆菌的靶向治疗提供新思路

　　【关键词】鸟分枝杆菌;结构;功能;生物信息学分析

　　[ Abstract] Objective To use bioinformatic analysis software to predict the structure and function of the Mycobacteri um avium mav-2052 protein Methods The uniprot database online, the protein analysis website ProtParam, ProtScale online. TMHMM (TMHMM Server V 2.0). Softberrv. SienalP 5.0. PSORT II Server, SOPMA, and SWISS-MOD-El were used to predict biological information such as the physical and chemical properties and hydrophobicity of the mav-2052 protein, to analyze its signal peptides, transmembrane regions, and subcellular localization, to predict its sec ondary structure, and to model its tertiary structure. The website was used to predict the protein's phosphorylation sites, the Blast tool of the uniprot protein database was used to compare amino acids, and the software MEGA-X was used to construct an evolutionary tree. Results mav-2052 is a protein encoding 310 amino acids. It originates from the same species as M. avium subtypes and has is highly similar to cysteine svnthase K1 of M. tuberculosis. mav-2052 is a stable hydrophobic protein with no transmembrane regions and no signal peptides. The protein is predicted to be located in the cytoplasm, and there are 13 serine phosphorylation sites in the protein sequence. The protein's secondary structure is dominated by alpha helices and it has two domains. mav-2052 is a cysteine synthase that belongs to the cysteine synthase/cysteine beta synthase family, and it is an important protein for regulation of the growth of M. avium. Conclusion Bioinformatics predicted that the M. avium mav-2052 protein is a cysteine synthase. This protein plays an important role in regulating the growth of M. avium. These findings may provide new insights in targeted therapy for M. avium

　　[ Key words] Mycobacterium avium; structure; function: bioinformatic analysis

　　鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium，MAV)属于细胞内寄生菌，是非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)中的一种[1]。研究表明，在健康人中也能建立慢性MAV感染，且多种抗分枝杆菌的药物治疗效果不佳，即使延长18~24个月的疗程也无法将其彻底清除[2);另一方面，MAV的感染在免疫系统受损的个体中引起NTM感染事件越来越多，且尚未制定出有效根除MAV感染的药物治疗方案和预防MAV感染的疫苗[2]，因此，研发有效的抗MAV的药物及疫苗是当务之急.MAV-2052是参与MAV致病的重要蛋白之一，其主要功能是调节宿主细胞氧化与抗氧化的平衡和影响1-半胱氨酸的生成。为进一步了解MAV-2052的结构和功能，本研究从蛋白序列查询、理化性质、多序列对比、疏水性分析、跨膜结构、信号肽分析和亚细胞定位等对MAV-2052蛋白进行生物信息预测和分析。

　　材料与方法

　　1数据资料的获取

　　通过美国国家生物技术信息中心NCB数据库对MAV-2052进行序列分析;登陆Uniprot蛋白数据库和NCBI网站，获取MAV菌株MAV-2052蛋白的基因序列和氨基酸序列。鸟型分枝杆菌亚种(M.avium subsp)、海德堡分枝杆菌(M.heidelbergense)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、新宿分枝杆菌(M.shinjukuense)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)核苷酸序列和氨基酸序列也同样从Uniprot蛋白数据库和NCB网站获取。

　　2生物信息学分析

　　运用在线uniprot蛋白数据库的Blast工具，将MAV-2052基因序列与同源性较高的核苷酸进行比对;比对后的氨基酸运用MEGA-X构建进化树;登录在线ProtParam蛋白分析网站对MAV-2052蛋白进行理化性质分析;运用Protcale对蛋白进行疏水性分析;运用TMHMM(TMHMM Server V 2.0)和Sig-

　　nalP 5.0对MAV-2052进行跨膜和信号肽预测;运用Softberry和PSORT Il Sserver对MAV-2052细胞定位分析;利用SOPMA和SWISS-MODEL对MAV-2052蛋白进行二、三级结构预测;对蛋白磷酸化位点进行预测。

　　结果

　　1 MAV-2052基因的特征

　　GenBank 中MAV-2052基因的登录号为ABK67788.1，基因又名：Cysk，基因序列全长933 bp，编码310个氨基酸的蛋白质。

　　2 MAV-2052蛋白的同源性预测和进化树构建

　　经氨基酸序列比对，鸟型分枝杆菌亚种(Mycobacterium avium subsp)、海德堡分枝杆菌、结核分枝杆菌、新宿分枝杆菌、嗜血分枝杆菌与MAV 104菌株MAV-2052蛋白的序列覆盖区域分别是：100%、91%，88.4%，86.5%和84.8%。多重序列比对分析显示，以上物种氨基酸之间的序列相似度较高(图1)用MEGA-X软件构建系统进化树，结果见图2。鸟型分枝杆菌亚种与MAV起源于同一物种，同源性较高。

　　3 MAV-2052蛋白序列信息及理化性质MAV104菌株MAV-2052蛋白相对分子质量为32.346 21 × 10"，理论等电点为4.86，其中丙氨酸(Ala)、缅氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)的含量较高，分别占氨基酸总量的14.2%、10.6%和9.7%。带负电荷的氨基酸残基数目(天冬氨酸+谷氨酸)为37个，带正电荷氨基酸残基(精氨酸+赖氨酸)为27个。不稳定系数为27.74，为稳定蛋白。脂肪系数为105.45，亲水性平均系数为0.214，为疏水性蛋白。

　　4 MAV-2052蛋白疏水性

　　MAV-2052蛋白282位谷氨酸(E)处疏水性得分较低(-2.033)，亲水性较强;81位亮氨酸(L)处的疏水性得分较高(2.811)，疏水性较强。疏水性分析显示，MAV-2052含有多个亲水性区域和疏水性区域，其分布聚集不明显(图3)。

　　5 MAV-2052的跨膜区、信号肽及亚细胞定位运用TMHMM Server V 2.0预测MAV-2052无跨膜区(图4)，运用signalP 5.0可以区分3种信号肽：1)Sec/SPI:“标准”分泌信号肽，由Sec转运蛋白转运并被信号肽酶1(Lep)切割;2)Sec/SPIl：由Sec转运蛋白转运并被信号肽酶11(Lsp)切割的脂蛋白信号肽;3)Tat/SPI：由Tat转运蛋白转运并被信号肽酶1(Lep)切割的Tat信号肽。预测结果显示该蛋白无信号肽，可推断不是分泌蛋白(图5)，Softberry预测该蛋白亚细胞定位在细胞质中并通过PSORT II Server验证。

　　6 MAV-2052蛋白二级结构及结构域的预测和分析MAV-2052氨基酸序列中，-螺旋(Alpha helix)

　　结构有114个氨基酸，占二级结构总数的36.77%;p-折叠(extended strand)结构有61个氨基酸，占总数的19.68%;p-转角结构有35个氨基酸，占总数的11.29%;无规则卷曲(random coil respectively)结构有100个氨基酸，占总数的32.26%(图6)，预测MAV-2052蛋白质有两个结构域，分别是位于7-293氨基酸保守蛋白家族的PLPdep和位于7-293氨基酸的PALP家族(图7)。

　　7 MAV-2052三级结构预测

　　MAV-2052三级结构的模型构建见图8，可形成同源二聚体，但没有和其他配体结合的空间位置，与Cysteine synthase A(2q3d.1.B)的相似度为88.39%。

　　8 MAV-2052蛋白磷酸化位点

　　预测MAV-2052蛋白有13个丝氨酸(Ser)磷酸化位点：7个苏氨酸(Thr)磷酸化位点，分别在93，97116，157，158，166，302位氨基酸处：139，299两处有酪氨酸(Tyr)磷酸化位点(图9)

　　讨论

　　近年来MAV感染率呈不断上升趋势，研发有效

　　的抗MAV的药物对于抗MAV感染至关重要，寻找新药靶点是当务之急。本研究采用生物信息学方法预测分析MAV-2052是存在于细胞质中的一种半胱氨酸合酶，属于半胱氨酸合酶/半胱氨酸B合成酶家族，是MAV重要的蛋白之一。该蛋白为疏水性蛋白，无信号肽，无跨膜区，且预测定位于细胞质中，是一种非分泌性蛋白，主要功能是调节宿主细胞氧化应激反应和影响1-半胱氨酸的生成。多重序列分析显示其与鸟分枝杆菌亚型氨基酸序列完全相同，与结核分枝杆菌的半胱氨酸合酶k，(cysteine synthase.Cysk，)的同源性较高。

　　MAV-2052蛋白具有催化活性：硫化物与0-乙酰基-1-丝氨酸在此酶的作用下生成醋酸盐和1-半胱氨酸。而同一条或不同多肽链的两个L-半胱氨酸残基间以二硫键(-s-s)连接，在人体内主要是保持蛋白质的稳定性[。同样也为发挥细胞正常的功能，抵御宿主细胞施加的氧化应激提供理论依据[5

　　在氧化应激中，一方面在半胱氨酸水平上序列比对结果显示，MAV-2052是与结核分枝杆菌有88.4%相似性的半胱氨酸合酶A蛋白]。在与MAV-2052蛋白同源性较高的结核分枝杆菌中已被证实氧化平衡与L-半胱氨酸的可用性有关[。在结核分枝杆菌感染宿主过程中，1-半胱氨酸不仅是抵抗宿主巨噬细胞吞噬后释放活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的第一道防线[1]，它还能修复被ROS破坏分枝杆菌蛋白的铁硫中心[2]，而且还是合成病原菌对抗氧化应激和在宿主中长期生存的关键[，有研究表明，致病菌能利用高活性的酶帮助其躲避宿主的防御机制，从而促进细菌感染的成功建立。此外，细胞宿主的防御机制还包括ROS的爆发，这可能导致过度氧化，然而这些高活性酶通过使用包括催化和非催化1-半胱氨酸的机制，设法避免不可逆转的失活t，当宿主中产生ROS时，结核分枝杆菌能够通过硫氧还蛋白和放线硫醇中关键的L-半胱氨酸的硫醇基团来抵消宿主来源的活性氧中间体(reactive oxygen intermediate.ROT)[1]，放线硫醇可增强细胞内ROS的清除作用，使细胞活力提高[2)，其1-半胱氨酸残基的疏基又可被亲电基团烷基化，并被ROS氧化[10]，在氧化还原机制中证实增加1-半胱氨酸的供应可防御ROS的产生对病原菌的破坏[]，另一方面证实用抑制剂与结核分枝杆菌的Cysk，结合可减少L-半胱氨酸的生物合成从而破坏病原菌[1]。以上机制在结核分枝杆菌中已被证实，由于MAV-2052蛋白与结核分枝杆菌具有较高同源性，且与CysK，的底物和生成的L-半胱氨酸产物也完全相同，因此预测可通过从头抑制L-半胱氨酸的生成来增加氧化应激中产生的ROS对MAV的破坏，从而作为新的抗菌药的目标。另一方面，活性氧的产生破坏了抗氧化的平衡引起细胞凋亡(。细胞凋亡是宿主对病原菌防御机制的一个重要反应，涉及多种成分和高度协调的信号转导[5]。许多细胞内细菌利用的是宿主的细胞器，在使细胞凋亡时主要通过调节宿主的细胞器来实现[1).Lee等[报道重组的MAV-2052蛋白在ROS的生成中以Caspase的方式诱导了巨噬细胞的凋亡。已被证实的凋亡途径是使线粒体跨膜点位丧失，BAX线粒体转位，细胞色素c释放从而诱导细胞的凋亡。细胞色素c的释放使Caspase活化[17，当Caspase一旦被活化，从而启动相关蛋白酶的级联反应[13]，当上游的Caspase-9活化通过一些途径使宿主细胞核的核孔损伤并使下游的Caspase-3也进入细胞核，使DNA降解，从而加速宿主细胞的凋亡[2-13]，本研究预测MAV-2052有多个磷酸化位点，说明该蛋白在对宿主细胞的信号转导也存在调控作用，其中ASK-JNK通路是MAV-2052在ROS介导的湖亡途径中的主要通路)。而线粒体是细胞内源性凋亡发生多种关键事件的中心细胞器，可改变促凋亡和抗凋亡分子的活性[13]。高浓度的ROS还会促进内源性中内质网应激反应(endoplasmic re-

　　ticulum stress，ERS)的凋亡信号通路。当ERS激活时，线粒体内的ROS也会增加，导致线粒体的膜电位稳态被破坏，通透性增加、线粒体中的促凋亡因子改变并释放，从而引起细胞凋亡[])。增加活性氧的产生可引起宿主抗氧化系统失衡导致细胞损伤和细胞器功能的丧失，从而促进MAV-2052蛋白的损伤加快细胞凋亡来杀伤MAViu本研究采用生物信息学方法预测分析MAV-2052为半胱胺酸合成酶，在MAV感染中调控1-半胱氨酸的生成和宿主细胞的氧化应激反应能控制其生长可为MAV感染的靶向治疗提供新思路。

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