天然植物人参中糖醛酸含量测定方法的建立

《天然植物人参中糖醛酸含量测定方法的建立》论文发表期刊：《今日畜牧兽医》；发表周期：2021年01期

《天然植物人参中糖醛酸含量测定方法的建立》论文作者信息：朱明月，女，本科，研究方向：可饲用天然植物饲料添 加剂的研发

　　摘要：目的建立天然植物人参中糖醛酸的含量测定方法。方法以间羟联苯法测定人参饮片中糖醛酸的含量，并对该方法的测定条件及供试品溶液制备方法进行优选，对方法学进行考察。结果供试液在3h内显色稳定，重现性好，平均回收率为100.49%，RSD为2.63%。糖醛酸含量为3.99%，RSD为1.23%。结论该方法简便、快速、准确。可为人参饮片中糖醛酸的质量控制提供参考。

　　关键词：人参;糖醛酸;问羟基联苯法

　　作为“东北三宝”之一的人参，在中国药用历史悠久。人参中含有多种有效成分，但对人参的研究，多集中于人参皂苷。近年来，关于人参多糖的报道越来越多，现代研究发现，人参多糖具有增强机体免疫力1和通过提高免疫力辅助抗肿瘤的作用10，显示多糖对人参药用价值的发挥亦起着重要作用。研究表明，人参多糖中的酸性多糖，即含有糖醛酸结构单元的多糖生物活性较高"0。目前，药典“人参"饮片项下只有人参皂苷含量的测定方法，但未见人参中糖醛酸含量测定方法研究的报道。因此，本试验拟建立一种准确可靠的人参中糖醛酸含量测定方法，为人参饮片中人参多糖的质量控制提供可借鉴的分析方法。

　　1仪器与材料

　　1.1仪器

　　UV2550型紫外-可见分光光度计(日本岛津)

　　AUW120D型电子天平(日本SHIMADZU公司)

　　1.2药物与试剂

　　D-半乳糖醛酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：

　　111646-200301，供含量测定用)，四硼酸钠(美国Sigma公司)，间羟联苯(美国Sigma公司)，咔唑(北京化学试剂公司)，其他试剂均为分析纯。

　　1.3药材

　　人参药材购于安国药材市场，经本公司质控部鉴别符合

　　《中华人民共和国药典》2015版(1部)有关项下规定122方法与结果

　　2.1供试品溶液的制备

　　取人参细粉0.25g，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150ml，加热回流1h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10ml，洗涤液弃去。将残渣及滤纸置烧瓶中，加水100ml，加热回流1h，滤过。残渣再加水100ml，加热回流1h，趁热滤过。残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10ml，合并滤液及洗涤液，放冷，转移至250ml.量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤纸过滤，取续滤液，即可。

　　2.2对照品溶液的制备

　　称取D-半乳糖醛酸对照品10.08mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.3显色剂的配制

　　2.3.1四硼酸钠-硫酸溶液的制备

　　称取四硼酸钠4.78g，置1000ml，量瓶中，加硫酸超声(功率250W，频率40kH2)使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(0.0125

　　mol/L.四硼酸钠-硫酸溶液)。

　　2.3.2间羟联苯溶液的制备

　　称取间羟联苯0.15g，置100mL.量瓶中，加0.5%的氢氧化钠溶液超声(功率250W，频率40kH2)使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(0.15%间羟联苯溶液)。

　　2.4显色条件考察

　　2.4.1最大吸收波长的选择

　　精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6mL，置具塞试管中，于冰水浴中分别加入0.4mL.纯化水，摇匀，于冰水浴中，加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.6ml，摇匀，置沸水浴中加热12min，取出，置冰水浴中放冷至室温，加人间羟联苯溶液80uL，摇匀，室温放置40 min，以1mlL.纯化水同上操作制得空白溶液调零，以紫外可见分光光度计，在400-700 nm进行光谱扫描，结果显示，525mm波长处吸光度值最大，因此，确定检测波长为525mm。

　　2.4.2四硼酸钠-硫酸溶液用量考察精密量取四硼酸钠-硫酸溶液3ml、4mlL，5ml.、6mL、7mL

　　8mL，分别置具塞试管中，于冰水浴中分别加入0.4mL.纯化水，摇匀，各加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.6ml，摇匀，其余操作同

　　2.4.1项，测定吸光度。结果显示：随着四硼酸钠-硫酸溶液用量的增加，D-半乳糖醛酸对照品溶液吸光度值先升高然后降低，其中以四硼酸钠-硫酸溶液用量为6ml.的吸光度值最大。因此，确定四硼酸钠-硫酸溶液最佳用量为6ml

　　2.4.3沸水浴时间考察

　　精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6mL，平行七份，分别置具塞试管中，于冰水浴中分别加入0.4mL.纯化水，摇匀，各加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.6ml，摇匀，置沸水浴中分别加热4min、6min、8min、10min，12min、14min，16min，其余操作同2.4.1项，测定吸光度。结果显示：沸水浴时间不同时，对照品溶液吸光度基本没有差异，说明沸水浴时间为4min时，已反应完全。

　　2.4.4间羟联苯用量考察

　　精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6mL，平行十份，分别置具塞试管中，于冰水浴中分别加入0.4ml.纯化水，播匀，各加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.6ml，摇匀，置沸水浴中加热4min，取出，置冰水浴中放冷至室温，再分别加入间羟联苯溶液30uL.40ul.

　　50 L.，60L70uL.80ul90uL 100uL，，其余操作同2.4.11项，测定吸光度。结果显示：随着间羟联苯用量的增加，对照品溶液吸光度值先增大后减小，其中以间羟联苯用量为80uL的吸光度值最大，因此，确定间羟联举最佳用量为804L

　　2.4.5显色时间(室温放置时间)考察

　　精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6ml，置具塞试管中，于冰水浴中加入0.5mL.纯化水，摇匀，加入D-半乳糖醛酸对照品溶液

　　0.5mlL，摇匀，置濡水浴中加热4min，取出，置冰水浴中放冷至室温，加入间羟联苯溶液80uL，摇匀，同法制备相应空白溶液，以紫外可见分光光度计，每隔5min测定一次525mm波长处的吸光度，连续测定60min，结果显示：显色时间不同时，对照品溶液吸光度的RSD值为0.30%，吸光度基本没有差异，说明显色5min即可。

　　2.5供试品溶液制备方法考察

　　2.5.1供试品溶液制备方法比较

　　为了考察人参皂苷对糖醛酸含量测定是否存在干扰，对80%乙醇醇提皂昔后再水提糖醛酸和直接水提糖醛酸的方法进行比较，光谱扫描图见图1。

　　显色后颜色比较：醇提皂昔后再水提糖醛酸，供试品溶液显色后为砖红色;直接水提糖醛酸，供试品溶液颜色为咖啡色，两种供试品溶液制备方法显色后颜色不一致。最大吸收波长比较：醇提皂背后再水提糖醛酸，最大吸收波长为525mm，与对照品最大吸收波长一致，直接水提糖醒酸，最大吸收波长为508nm，与对照品最大吸收波长525mm不一致。综上所述，若直接水提进行显色，则药材中人参皂苷对糖醛酸含量测定存在干扰。因此，需醇提皂昔排除干扰后再水提糖醛酸进行检测，

　　2.5.2醇提次数比较

　　对80%乙醇醇提皂昔的次数(1次、2次、3次)进行了比较，结果显示：醇提次数不同时，供试品溶液显色后颜色一致，均为砖红色，且最大吸收波长均在525nm附近，且糖醛酸含量差异较小，说明提取1次，人参皂昔已提取完全，因此确定80%乙醇醇提次数为1次。

　　2.5.3溶剂用量考察

　　对糖醛酸提取溶剂(水)用量-50mlL、100mL、150mL.

　　200ml进行了考察，结果显示：随着溶剂用量的增加，糖醛酸含量增高，但溶剂用量为100mL，、150mL和200mL时，糖醛酸含量差异较小，因此，确定溶剂用量为100mL。

　　2.5.4水提次数考察

　　对糖醛酸水提次数进行了考察，结果显示：随着水提次数的增加，糖醛酸含量增高，但水提2次和3次，糖醛酸含量差异较小，说明提取2次，糖醛酸已提取完完全。因此，确定水提次数为2次。

　　2.6标准曲线的制备

　　精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6ml，置具塞试管中，平行六份，于冰水浴中分别加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.1mL.

　　0.2mlL.0.3mL 0.4mL.0.5ml、0.6mL，以纯化水补足1.0ml，摇匀，置沸水浴中加热4min，取出，置冰水浴中放冷至室温，再分别加人间羟联苯溶液80uL，摇匀，室温放置5min，同法制备空白溶液，以紫外可见分光光度计，分别测定525nm处的吸光度，并制备标准曲线，结果见图2

　　上述结果显示：以D-半乳糖醛酸浓度为横坐标()，吸光度为纵坐标(y)作标准曲线，方程为y=0.0132x-0.0168(=0.9997)，说明D-半乳糖醛酸溶液对照品溶液在10.08ug/mL-60.484g/

　　ml范围内线性关系良好。

　　2.7方法学考察

　　2.7.1重复性考察

　　按取样量0.8：1.01.2的比例分别称取样品，各平行三份，精密称定，按已确定的方法制备供试品溶液，并吸光度，计算糖醛酸含量。九份样品测定结果RSD值为2.26%，该方法重复性良好。

　　取对照品溶液及重复性考察项下的供试品溶液，以间羟联苯法显色，对对照品溶液和供试品溶液连续测定6次525mm处吸光度，计算RSD值。对照品和供试品溶液RSD值分别为

　　0.08%和0.00%，该方法精密度良好。

　　2.7.3稳定性考察

　　取对照品溶液及重复性考察项下的供试品溶液，以间羟联苯法显色，每隔30min测定一次525mm处的吸光度，连续测定3h，计算RSD值。对照品和供试品溶液RSD值分别为0.77%和

　　2.15%，表明供试品溶液在3h内显色稳定。

　　2.7.4回收率考察

　　按取样量0.25g的1/2即0.125g称取本品，精密称定，平行9份，取已知浓度的的D-半乳糖醛酸对照品溶液，按照0.8：1.0：

　　1.2的比例分别加入样品溶液中，各平行三份，按确定的样品处理方法制备供试品溶液，以间羟联苯法测定糖醛酸含量，计算回收率及回收率的RSD值。结果见表1上述结果显示：九份供试品溶液中，D-半乳糖醛酸回收率介于95%105%之间，回收率均值为100.49%，RSD值为2.63%，该方法回收率良好。

　　2.8人参多糖中糖醛酸的含量测定

　　精密称取人参细粉0.25 g，按照"2.1"项下供试品溶液制备方法和"2.4"项下显色条件显色，测定吸光度，计算供试品溶液中糖醛酸含量。结果人参中糖醛酸含量为3.99%，RSD为1.23%(n=3)。

　　3讨论

　　文献显示，糖醛酸含量测定方法分为“咔唑法”和间羟联苯法"两种，味唑法收载于《国家中成药汇编》中"人参多糖注射液项下;间羟联苯法见于文献，该文献报道咔唑法在测定人参酸性多糖中糖醛酸含量时，因中性糖与硫酸咔唑络合形成棕色衍生物，从而对糖醛酸含量测定存在干扰。笔者对啡唑法和间羟联苯法进行了比较，试验结果显示：采用间羟联苯法测定时，对照品溶液和供试品溶液最大吸收波长均为525nm，且供试品溶液和对照品溶液均为紫红色;采用咔唑法测定时，对照品溶液最大吸收波长在525mm，而供试品溶液最大吸收波长在539mm，两者最大吸收波长不一致，对照品溶液为紫红色，而供试品溶液为咖啡色;且咔唑法和间羟联苯法相比，供试品溶液的吸光度咔唑法比间羟联苯法高0.286，说明咔唑法测定糖醛酸含量时，确实对测定结果的影响，同时验证间羟联苯法的可行性。因此，确定人参伙片中糖醛酸含量测定方法为间羟联苯法。

　　供试品溶液制备方法考察过程中，考虑到人参中含有皂苷和多糖两类成分，因此，笔者对皂昔是否对糖醛酸含量测定存在干扰进行了考察，结果发现，皂昔类成分存在时，间羟联苯法显色后，供试品溶液的颜色和最大吸收波长均存在差异，说明皂昔类成分的存在，对糖醛酸含量测定确实存在干扰。因此，供试品溶液制备方法中确定先醇提除去人参皂昔，然后再水提多糖，以保证含量测定方法的准确度。

　　经多次试验验证，间羟联苯法测定人参饮片中糖醛酸含量，重复性好，准确度高，适用于人参饮片中糖醛酸含量的测定。该方法可为药典“人参”饮片项下人参酸性多糖质量控制提供参考，以便更好地控制人参伙片质量。

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