锈菌效应子的研究现状与展望

　　摘要：锈菌是最大的一类植物病原真菌，其引起的病害严重威胁着全球农业生产安全。锈菌作为活体营养寄生菌，在其与寄主互作过程中，会分泌大量效应子以促进其侵染。开展病菌效应子调控寄主免疫机制的研究将为锈病持久绿色防控提供理论依据。本文主要针对锈菌效应子的功能及其调控寄主免疫机制方面的研究进行了概述，并对锈菌效应子今后的研究方向进行了展望。

　　关键词：锈菌;寄主植物;效应子;植物病原互作

　　锈菌目是真菌界最大的目之一，目前报道该目已有000余种(AimeMcTaggart，2021)。由锈菌引起的病害不仅能够危害如小麦、大豆和咖啡等作物导致作物产量降低品质下降，也能够危害杨树、桉树和松树等树木影响木材产量(Deanetal.，2012;Fisheretal.，2012;Sniezkoetal.，2012)。自1990年以来，大豆锈菌Phakopsorapachyrhizi引起的大豆锈病在南美洲造成每年超过20亿美元的经济损失(Godoyetal.，2016;Goellneretal.，2010)。在非洲、亚洲以及南美洲，由咖啡驼孢锈菌Hemileiavastatrix引起的咖啡叶锈病造成每年20亿30亿美元的损失(Talhinhasetal.，2017)。

　　由小麦锈菌引起的锈病严重威胁着世界粮食安全。据统计，全球每年由小麦锈病造成的经济损失达到40亿50亿美元(Figueroaetal.，201)。我国作为小麦条锈病最大的流行区，自1950年以来暴发了次严重的小麦条锈病大流行，给小麦生产造成了巨大损失，严重威胁着我国的粮食安全(Zengetal.，2021)。锈菌是一类活体营养专性寄生菌，具有复杂的生活史，多数需要在种不同寄主(转主寄主)上侵染来完成其整个生活史，在不同生长阶段会产生性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子种不同类型的孢子(Aimeetal.，2017)。

　　作为活体营养寄生真菌，锈菌能够侵入植物组织中，突破植物细胞壁后在壁内扩张，同时内陷周围寄主质膜，形成管状的颈部和顶端膨大的吸器(康振生等，1994;Garnicaetal.，2014)。锈菌吸器不仅是病原物吸收营养的主要场所，而且也是分泌蛋白(效应子)大量表达分泌的主要场所(Garnicaetal.，2014;Sperschneideretal.，2015)。一直以来，由于锈菌无法离体培养且缺乏稳定遗传转化体系，严重制约了其功能基因组学的研究。

　　因此，亟需解析锈菌与寄主植物的互作机制，为锈菌的持久绿色防治提供理论依据。植物与病原菌在长期“军备竞赛”的过程中，发展出了病原相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern，PAMP)诱导的免疫(PAMPtriggeredimmunity，PTI)与效应子诱导的免疫(ffectortriggeredimmunity，ETI)这个层次的免疫模式。植物细胞表面模式识别受体(patternrecognitionreceptor，PRR)通过识别PAMP如鞭毛蛋白、几丁质等来激活第一层PTI反应。

　　为了对抗PTI，病菌则通过分泌效应子干扰植物PTI反应，从而促进其在寄主中的定殖。为了应对病原物这一策略，植物会利用抗病(resistance，)蛋白来特异性识别某些效应子，从而触发ETI反应。ETI与PTI反应的理论框架构成了经典认知的Zigzag模型(JonesDangl，2006)。研究表明，PTI与ETI可以共用一些主要免疫组分(Pruittetal.，2021)，同时ETI与PTI反应也能够相互促进，从而产生更强的免疫反应(Ngouetal.，2021;Tianetal.，2021;Yuanetal.，2021)。

　　锈菌与寄主的互作也符合“基因对基因”假说，即每个寄主的抗病基因，在病原物中都有其对应的无毒(avirulence，Avr)基因与之识别，从而触发ETI反应(Flor，1971)。随着对病菌效应子研究的不断深入，发现病菌分泌的效应子不仅可以抑制PTI反应，同时也能够抑制寄主的ETI反应(Bourrasetal.，2015)。在锈菌与植物互作过程中，病菌效应子发挥着重要作用，解析其调控植物免疫机制成为目前的研究前沿和热点。近年来，随着基因组学及分子生物学技术的高速发展，锈菌效应子及其调控植物免疫机制解析等方面的研究也取得了一定进展。本文综述了近年来锈菌效应子功能及其调控植物免疫研究的现状，并对未来值得关注的重点研究方向进行了探讨，以期为植物锈病的持久绿色防控提供策略和理论依据。

　　1锈菌分泌蛋白组

　　广义上，能够改变植物细胞结构和功能，从而促进病原菌定殖或触发寄主防卫反应的蛋白质和小分子都可以定义为效应子，包括了PAMP、无毒蛋白(Avr)、毒素以及一些降解酶等(Hogenhoutetal.，2009)。一般认为，效应子具有一个N端含15~30个疏水性氨基酸残基构成的信号肽，不具有保守结构域，长度小于300个氨基酸，且富含半胱氨酸以形成二硫键增强蛋白质的稳定性(Duplessisetal.，2011;Ganetal.，2013)。随着越来越多的研究表明，蛋白长度大于300个氨基酸或含有某些酶、酶抑制剂、糖结合蛋白和毒素等保守结构域的病菌蛋白同样可以发挥效应子功能(Maetal.，2015;Salcedoetal.，2017)。

　　近10年来，随着测序技术的不断发展和完善，越来越多的锈菌基因组被公布，为锈菌分泌蛋白组的预测与分析奠定了重要基础。与其他担子菌大小约47Mb的基因组相比较(Mohanta&Bae，2015)，侵染单子叶植物的锈菌基因组大小在53~135Mb，而侵染双子叶植物的锈菌基因组大小在101~1000Mb。与之对应，担子菌平均基因数量约为15400个(Mohanta&Bae，2015)，而侵染单子叶植物的锈菌基因数量有14321~28801个，侵染双子叶寄主的锈菌基因数量有13364~16399个。

　　这些结果表明，尽管锈菌缺少一些保守的基因，但是显然其拥有更为庞大的基因组。借助基因组信息，利用N端信号肽预测、跨膜结构等特征分析，在侵染单子叶植物的锈菌基因组中预测到518~2999个分泌蛋白，而在侵染双子叶植物的锈菌基因组中预测到615~1184个分泌蛋白。目前现有数据表明，锈菌的分泌蛋白数量相较于白粉菌分泌蛋白数量出现了显著增加，这可能与锈菌复杂的生活史以及具有转主寄主现象有关(Barsoumetal.，2019)。亚麻锈菌Melampsoralini在亚麻上可以完成其完整的生活史，而其预测的分泌蛋白只有762个，明显少于拥有转主寄主的其他锈菌(Nemrietal.，2014)。

　　另外，杨树锈菌Melampsoralaricipopulina侵染杨树及其转主寄主落叶松，和小麦条锈菌Pucciniastriiformisf.sp.tritici侵染小麦及其转主寄主小檗的转录组测序数据表明，锈菌在2种不同寄主上分别有特异性表达的分泌蛋白(Lorrainetal.，2018;Zhaoetal.，2021)。这些研究为上述的推测提供了证据。尽管目前完成测序的只有少数锈菌，并且大部分为双核基因组，但随着组装技术与测序技术的发展，锈菌的2种单倍型基因组高质量组装成为可能(Lietal.，2019a;Milleretal.，2018;Schwessingeretal.，2018)，这有助于更加准确地预测锈菌基因组和加速对锈菌功能基因组学的研究进展。

　　2锈菌毒性效应子与植物免疫

　　2.1质外体效应子

　　质外体由细胞壁和外绕共质体的胞外空间组成。质外体中包含的植物细胞壁以及植物分泌的一些蛋白酶和抗菌蛋白等从物理以及化学层面防御病原物的入侵。植物细胞膜上还存在着PRR，能够识别内源性的损伤相关分子模式(damageassociatedmolecularpattern，DAMP)或PAMP来激发植物PTI免疫(Boutrot&Zipfel，2017)。

　　作为应对策略，病原物分泌质外体效应子来突破物理以及化学防御，并通过各种机制干扰质外体的免疫。蚕豆锈菌Uromycesfabae中的锈菌转运蛋白1(rusttransferredprotein1，RTP1)是第1个被鉴定到的能够转移到植物细胞中的真菌效应子。RTP1在吸器外间质中参与微丝骨架的形成从而稳定真菌结构，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性(Kemenetal.，2005;2013;Pretschetal.，2013)。

　　植物病程相关蛋白1(pathogenesisrelatedprotein1，PR1)的C末端短肽CAPE1(cysteinerichsecretoryprotein，antigen5andpathogenesisrelatedprotein1(CAP)derivedpeptide1)能够作为DAMP激发免疫反应(Chenetal.，2014)。小麦条锈菌与叶锈菌中的PNPi(Puccinianonexpresserofpathogenesisrelatedgenes1(NPR1)interactor)被报道可以在质外体中靶向小麦病程相关蛋白(TriticumaestivumPR1a，TaPR1a)的C端，抑制植物免疫(Bietal.，2020)。几丁质作为真菌典型的PAMP能够激发植物PTI反应。小麦条锈菌另一个质外体效应子Pst_13661编码1个多糖脱乙酰化酶，能够修饰条锈菌细胞壁几丁质，增加了植物几丁质酶识别底物的难度，降低几丁质的激发子活性，最终削弱植物应答几丁质诱导的免疫反应(Xuetal.，2020)。

　　活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)迸发作为免疫反应标志，也成为了病原物攻击的靶标。小麦条锈菌中，通过向质外体中分泌锌过氧化物歧化酶1(superoxidedismutase1，SOD1)以及过氧化氢酶1(catalase1，CAT1)来清除植物产生的活性氧从而帮助自身侵染(Liuetal.，2016a;Yuanetal.，2021b)。在杨树锈菌中，Mlp124202与突触结合素(synaptotagminA，SYTA)在细胞膜上互作(Gaouaretal.，2016)。而Mlp124357的GxxG基序帮助其定位于细胞膜上，进而识别拟南芥蛋白二硫键异构酶11(Arabidopsisproteindisulfideisomerase11，AtPDI11)发挥其致病功能(Madinaetal.，2020)。尽管质外体效应子的研究取得了一定进展，但目前锈菌中的PAMP分子仍没有鉴定到，这在一定程度上限制了对锈菌质外体效应子的研究。

　　2.2胞质效应子

　　除了质外体效应子外，许多真菌效应子可以通过分泌至胞间质再转运到植物细胞内，与细胞质、细胞核以及细胞器内不同成分相互作用，从而促进病原物侵染。例如油菜黑胫病菌Leptosphaeriamaculans无毒效应子AvrLm1最早被认为在胞间质积累(Goutetal.，2006)。

　　然而，最新的研究表明AvrLm1在欧洲油菜中与细胞有丝分裂原活化蛋白激酶9(cytoplasmicmitogen‐activatedproteinkinase9，BnMPK9)互作，增强其稳定性进而增强依赖BnMPK9的细胞死亡(Maetal.，2018)。此外大麦白粉菌Blumeria.graminisf.sp.hordei效应子CSEP0105靶向胞质中的小分子热休克蛋白(smallheatshockprotein，sHSP)，通过抑制其分子伴侣活性以提高病原菌毒性(Ahmedetal.，2015)。通过免疫荧光定位发现，蚕豆锈菌中的效应子UfRTP1能够从吸器外间质转运至植物细胞质与细胞核中，然而其在胞内发挥的功能仍然有待研究(Kemenetal.，2005;2013;Pretschetal.，2013)。

　　在小麦条锈菌中效应子UfRTP1的直系同源蛋白Pst18363靶向小麦防卫反应负调控因子(nucleosidediphosphateslinkedtosomemoietyX，TaNUDX)水解酶23(TaNUDX23)，通过稳定TaNUDX23促进小麦条锈菌侵染(Yangetal.，2020)。小麦条锈菌效应子Hasp8被证明能够在细胞质中抑制植物基础免疫(赵聪聪等，2020)。

　　另一个条锈菌中胞质效应子PstPEC6能够与拟南芥腺苷激酶(Arabidopsisadenosinekinase，ADK)互作，并通过调控ADK活性影响下游细胞分裂素的产生与甲基化转移，进而促进小麦条锈菌生长(Liuetal.，2016b)。NPR1是介导植物系统获得抗性(systemacquiredresistance，SAR)的重要调控因子。条锈菌中的PNPi除了能够在质外体中与植物病程相关蛋白TaPR1a互作调控植物免疫外，还可以借助其N端的RxLRDeerlike结构域转运至细胞质靶向小麦NPR1，通过竞争性抑制NPR1与TGA2转录因子结合，干扰植物的SAR(Wangetal.，2016)。

　　2.3细胞核效应子

　　核靶向效应子一直是真核生物效应子中的研究热点，目前已发现多例真菌、卵菌效应子能够进入植物细胞核，并干扰植物核中生物功能。例如卵菌中皱缩坏死(crinklingandnecrosisprotein，CRN)类效应子以植物细胞核核为靶标(RamirezGarcésetal.，2016;Schornacketal.，2010;Stametal.，2013)。锈菌中已鉴定的效应子中带有核定位信号(nuclearlocalizationsignal，NLS)序列或者锌指结构等DNA结合区域仍比较少。亚麻锈菌无毒效应子AvrP中存在锌指结构，这一结构被标注为经典DNA结合区域，随后的亚细胞定位表明AvrP可能靶向细胞核(Zhangetal.，2018)。

　　一些关键的免疫因子被证明能够在细胞质与细胞核中穿梭(Garcíaetal.，2010)。小麦条锈菌中核质靶向效应子PstGSRE1与ROS正向调控转录因子TaLOL2在细胞质中互作，进而干扰TaLOL2进入细胞核内激发下游ROS相关免疫反应(Qietal.，2019)。亚麻锈菌中的效应子Mlp124478能够在植物细胞核与核仁中积累，并通过结合TGA1a启动子序列从而抑制防卫反应基因的表达(Ahmedetal.，2018)。

　　3无毒效应子与植物免疫Flor(1971)

　　基于亚麻锈菌亚麻互作系统提出“基因对基因”假说，即寄主R蛋白特异性识别病原菌的无毒蛋白Avr触发植物ETI免疫。锈菌与植物的互作符合经典的“基因对基因”学说，因这种互作机制在病理学中的重要性而长期成为锈菌领域的研究重点。伴随着寄主抗锈菌R基因的克隆，锈菌无毒基因的克隆也取得了进展。

　　迄今为止，在锈菌中先后报道了9个位点的无毒基因的克隆。通过对亚麻锈菌杂交F1代菌株CH5的自交群体，通过图位克隆鉴定到6个无毒基因AvrL567、AvrM、AvrP4、AvrP123、AvrM14和AvrL2(Doddsetal.，2004;Catanzaritietal.，2006;Andersonetal.，2016)。通过对小麦秆锈菌诱变群体及自发突变群体与相应亲本菌株进行比较分析，克隆到3个无毒基因AvrSr35、AvrSr50及AvrSr27(Chenetal.，2017;Salcedoetal.，2017;Upadhyayaetal.，2021)。此外，在咖啡驼孢锈菌H.vastatrix中也报道了1个能与寄主抗病基因SH1特异性识别的效应子基因HvEC016(Maiaetal.，2017)。

　　锈菌自然群体及有性群体中无毒基因及其编码产物的序列多态性在一定程度上反映了其躲避植物免疫系统识别的策略及进化历程。亚麻锈菌的无毒蛋白AvrL567在群体中的毒性序列与无毒序列的差异集中反映为氨基酸的替换，序列差异最高可达20%，但序列长度始终保持一致，暗示AvrL567的序列完整对病原菌侵染定殖具有正向作用。然而自然群体中部分AvrL567序列可以被L5、L6、L7其中之一识别而不与另外2个抗病蛋白作用，反映了病原菌与植物互作逐步演化的过程(Doddsetal.，2006)。AvrM在亚麻锈菌CH5自交群体中出现了5种无毒序列，除了序列差异外编码产物长度也出现了差异，而在唯一的毒性蛋白avrM序列上出现两段缺失以及14个多态性位点(Catanzaritietal.，2006)。

　　对AvrL567及AvrM相关无毒蛋白的晶体结构解析显示大部分在毒性序列中出现多态性的氨基酸位于蛋白表面，这种改变显著影响了无毒蛋白表面的理化性质，可能因此影响了与R蛋白的识别(Wangetal.，2007;Veetal.，2013)。AvrP4序列在群体中的差异也反映为氨基酸的替换，且多态性基本集中于C端，并且序列中的6个半胱氨酸在群体中高度保守(Catanzaritietal.，2006)。AvrL567、AvrM和AvrP4的编码区域在自然群体中的多态性显著性高于其周围的基因组序列，暗示无毒基因编码区域处于更高的自然选择压力下(Doddsetal.，2004;Catanzaritietal.，2006)。AvrL2的毒性变化也同时体现在氨基酸的替换与编码产物长度的多态性上。

　　而染色体的大片段缺失造成AvrM14基因序列丢失是M1、M4无毒菌株产生自发毒性突变的主要原因(Andersonetal.，2016)。对抗病基因Sr35表现为无毒的小麦秆锈菌菌株在经甲磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS)处理后，AvrSr35序列上产生了多种非同义单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)，导致毒性突变。而在自然群体无毒菌株中的AvrSr35到毒性菌株中的avrSr35的变化则主要来自于微型反向重复转座(miniatureinvertedrepeattransposableelement，MITE)元件的插入(Salcedoetal.，2017)。

　　AvrSr50功能的丧失则主要来自大片段插入，目前仅发现少数avrSr50来自于氨基酸序列多态性(Chenetal.，2017)。最新报道的小麦秆锈菌无毒基因AvrSr27在无毒菌株与毒性菌株间存在拷贝数差异，此外毒性菌株中的avrSr273序列编码产物也可以与Sr27识别并引起过敏性坏死(hypersensitiveresponse，HR)，但其在无毒菌株中的表达量显著低于AvrSr271，推测无毒基因表达量未达到阈值也可能是造成毒性变异的原因(Upadhyayaetal.，2021)。

　　4展望

　　效应子在病原物与植物互作体系中发挥着重要作用。大量证据表明，效应子可以从多个通路干扰植物免疫从而促进病原物侵染，与此同时，效应子也会被植物免疫系统识别从而触发植物免疫(Heetal.，2020;Tariqjaveedetal.，2021)。对于效应子功能研究的深入解析，能够拓展病菌致病机理研究，进而为开辟持久有效的抗病防控策略奠定了基础。

　　对于锈菌来说，无法进行稳定遗传转化是限制其功能基因组学研究的最大阻碍。尽管在亚麻锈菌中报道了一种稳定转化体系(Lawrenceetal.，2010)，但是迄今为止，这种方法未见成功应用的报道。寄主诱导的基因沉默技术(hostinducedgene silencing，HIGS)的出现为解决锈菌目前研究困境带来了新的方向(Nowaraetal.，2010)。HIGS技术是在RNA干扰(RNAinterference，RNAi)与病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing，VIGS)技术基础上发展起来的，通过将病原菌靶基因序列互补的双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)导入植物中，被识别后产生21~35nt的小干扰RNA分子(smallinterferingRNA，siRNA)。

　　当病原菌侵入植物时，植物体内的dsRNA或者siRNA通过某种途径进入病原菌中，特异性沉默病原菌靶基因。因此可以利用HIGS技术快速筛选致病相关效应子，例如小麦条锈菌效应子PstGSRE1、Pst18363以及Pst_13661等(Qietal.，2019;Xuetal.，2020;Yangetal.，2020)。同时，利用转基因HIGS技术沉默病原菌致病因子已获得了一批稳定的小麦抗条锈病材料，为植物抗锈病资源的开发及应用提供了新途径。

　　可预见的是，由于效应子的遗传多样性，利用HIGS技术沉默重要保守效应子以创制抗病材料为锈病绿色防控的重要策略之一。近年来，锈菌效应子的鉴定及其调控植物免疫机制的研究已取得了一定进展，但关于锈菌效应子转运问题仍然亟待解决。卵菌效应子中存在着一类RxLREER基序，被证明参与效应子的转运(Wawraetal.，2017)，然而真菌中对于效应子的转运信号知之甚少。通过免疫胶体金试验证实了蚕豆锈菌效应子RTP1以及亚麻锈菌效应子AvrM能够进入植物细胞内(Kemenetal.，2005;2013;Rafiqietal.，2010)。通过免疫荧光试验证明杨树锈菌中的几个效应子可以在吸器周围检测到(Hacquardetal.，2012)。

　　尽管免疫胶体金与免疫荧光试验可以证明效应子的转运，但也面临着单抗制备周期长且价格昂贵、免疫信号检测困难等问题。近期关于效应子的报道中，大都借助于酵母、烟草以及植物原生质体等异源系统来观察效应子的分布。值得关注的是，目前效应子在稻瘟菌Magnaporthegrisea中的转运研究已经开展了一系列的工作，多个效应子能够在吸器与生物营养界面复合体(biotrophicinterfacialcomplex，BIC)以及植物中被检测到(Kimetal.，2020)。

　　同时，在禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum中效应子Osp24的研究中，通过将带有核定位信号Osp24NLSGFP融合荧光蛋白在禾谷镰刀菌中表达后接种小麦，通过在小麦的细胞核中检测到GFP荧光信号证明了Osp24可以转运到植物细胞内部(Jiangetal.，2020)。

　　借助于稻瘟菌/禾谷镰刀菌体系，将锈菌效应子在该体系中表达为研究者们提供了一种证明效应子转运的思路。效应子的研究工作为植物病理学的研究开启了新的大门，锈菌作为活体营养专性寄生菌拥有大量潜在的效应子，只有少部分的效应子功能被解析，在许多方面的研究仍处于起步阶段。PAMP作为被植物第一层免疫系统识别的分子，在植物病原物分子互作研究中具有重要意义。

　　近年来，不断有其他病原物中的PAMP分子被鉴定，如尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum中的FoEG1、苹果树腐烂病菌Valsamali的VmE02等(Nieetal.，2019;Zhangetal.，2021)。鉴定并解析锈菌中的PAMP效应子将是未来研究热点之一。研究发现，大麦白粉菌中的Avrk1和Avra10，大丽轮枝菌Verticilliumdahliae中的Vdlsc1以及玉米瘤黑粉菌Ustilagomaydis中的Cts1均不含有N端信号肽序列，被证明为非典型分泌的效应子(Ridoutetal.，2006;Liuetal.，2014;Terfrüchteetal.，2017)。

　　目前对锈菌效应子的研究仍然集中在含有N端信号肽并通过经典高尔基体内质网系统分泌的效应子，锈菌中的非典型分泌蛋白还未见报道。无毒效应子的鉴定与功能解析，有助于加速解析病原物毒性变异的分子机理，能够为锈病的防控提供重要的理论支撑。目前锈菌无毒效应子克隆的报道仍然只集中在亚麻锈菌与小麦秆锈菌中。

　　通过锈菌有性群体的创制，借助于传统图位克隆或全基因组重测序，以及通过EMS诱变等方法创制突变菌系等方法，能够加速无毒效应子的鉴定。对锈菌无毒基因的鉴定与功能解析以及对参与或干扰植物ETI反应效应子的研究将是未来锈菌效应子的研究热点。这些研究将为深入了解锈菌与植物互作机制带来新的视角，并为创制广谱抗锈病材料及病害的绿色持久控制开辟新的视野。

　　作者：郭嘉钱朝伟朱浩川郭军康振生