栽秧泡果酒发酵工艺优化及挥发性风味物质分析

　　摘要：目的：充分利用野生栽秧泡资源，解决栽秧泡不易贮藏和运输的问题，提高其附加值。方法：以野生栽秧泡果实为原料，葡萄酒-果酒专用酵母为菌种，优化栽秧泡果酒发酵工艺，并采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC-MS)分析栽秧泡果酒挥发性风味物质的种类及相对含量。结果：栽秧泡果酒最适发酵条件为：酵母接种量0.7%，主发酵温度30℃，初始糖浓度25%，初始pH3.9。在此发酵条件下的果酒感官评分为92.10分，各项理化指标分别为：酒精度数11.46%vol，总糖3.89g/L，总酸13.04g/L，可溶性固形物7.64°Bx，pH4.37;分析并鉴定出24种挥发性风味物质，其中醇类、酯类和酸类物质占总挥发性物质的79.29%，是构成栽秧泡果酒挥发性风味成分的主要基础物质。结论：研究结果填补栽秧泡果酒发酵工艺上的研究空白，为其果酒的规模化生产提供参考。

　　关键词：栽秧泡果酒;发酵工艺;感官评价;挥发性化合物

　　栽秧泡(Rubusellipticusvar.obcordatus)是蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)空心莓组植物[1]，在我国西南多省海拔300～2000m区域有分布，果实呈黄色，酸甜可口，含有丰富的可溶性糖、维生素、蛋白质和氨基酸等，是一种极具经济价值但有待开发的野生小浆果[2]。然而，主干具爪、叶背具毛刺等特征，使得栽秧泡机械采收困难;果实成熟期季节性强且与雨季重叠、果实无毛易破损等特性，加大了栽秧泡果实贮藏运输的难度[1，3];所以栽秧泡多以鲜果的形式在分布区周围小范围上市，严重限制了栽秧泡相关产业的发展。果酒的开发不仅可以一定程度上缓解栽秧泡货架期短和运输的困难，而且能够解决季节性成熟导致的浪费，同时果酒还能保留栽秧泡特有的营养成分和果香，创造良好的经济效益[4-5]。果酒是以水果为原料，通过发酵将水果或果汁中的糖分代谢后得到的低酒精度营养保健型酒[6]。

　　发酵论文范例：猕猴桃茶酒的发酵工艺研究

　　其口感温和、滋味独特、营养价值高，深受消费者青睐。因此，不断有研究者探讨果酒发酵过程中酵母种类、发酵时间、初始糖度、初始pH、温度等参数对发酵进程和发酵产物的影响，以期能够得到健康、营养、美味的各类果酒[7-9]。小浆果酿造果酒是目前研究的热点[4，9-11]，但对于栽秧泡果酒酿制工艺却仍然缺乏研究。本研究以栽秧泡果实为原料，探讨酵母接种量、主发酵温度、初始糖浓度、初始pH等因素对栽秧泡果酒的酒精度数、总酸、可溶性固形物、pH的影响，并采用顶空-固相微萃取(headspacesolidphasemicroextraction，HS-SPME)和气相色谱-质谱联用(gaschromatographymassspectrometry，GC-MS)仪对最优发酵工艺下栽秧泡果酒的挥发性风味物质进行分析，以期能为野生小浆果果酒的生产提供借鉴。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　野生栽秧泡：采自云南省保山市隆阳区附近山林，挑选无病、无虫、无害、成熟度高的新鲜栽秧泡鲜果装入密封袋中，-20℃贮藏，用前12h置于室温自然解冻;葡萄酒-果酒专用酵母(Saccharomycescerevisiae)、果胶酶(40000U/g)：帝伯仕酵母有限公司;白沙糖、矿泉水、柠檬酸、食用碱：市售(均为食品级);氢氧化钠、盐酸、葡萄糖标准品、苯酚、硫酸、酒石酸、无水乙醇、酚酞、亚硫酸氢钠均为分析纯。

　　1.2仪器与设备

　　GXZ-30温培养箱：宁波东南仪器有限公司;JYL-C012榨汁机：九阳股份有限公司;SWCJZD无菌接种台：苏州净化设备有限公司;TDL.5A离心机：上海安亭科学仪器有限公司;UV-2600紫外可见分光光度计：日本岛津公司;PHS-3CpH计：上海仪电科学仪器股份有限公司;JK-119手持式折射仪：北京金科利达电子科技有限公司;手持折光仪：邦西仪器科技(上海)有限公司;顶空固相微萃取装置(SPME手柄、50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取头)：美国Supelco公司;TRACE1300+ISQGC-MS联用仪：赛默飞世尔科技公司。

　　1.3方法

　　1.3.1栽秧泡果酒酿造工艺

　　将自然解冻后的栽秧泡果实用榨汁机榨汁后，按照酶解→过滤→调整果汁成分→灭菌→接种→主发酵→后发酵→离心(澄清)等步骤[12-13]制得栽秧泡果酒。操作要点：葡萄酒-果酒专用酵母以1∶10的比例溶解于2%的蔗糖水溶液中，32℃活化30min。按果汁总质量的0.02%加入果胶酶搅拌均匀，于室温下酶解3.0h;以四层纱布过滤酶解后的果汁;添加160mg/L亚硫酸氢钠[14]，根据单因素加入白砂糖调整果汁的初始糖度，用柠檬酸或食用碱调整果汁的初始pH;75℃水浴锅中恒温灭菌15min[14]。冷却后，按单因素接种活化好的酵母，在试验温度下主发酵12d(预实验表明12d以后，残糖量低于0.4%)。将主发酵后的果酒转移至28℃培养箱中，恒温发酵30d。澄清：离心机3500r/min离心3min，上清液即为待测栽秧泡果酒。

　　1.3.2栽秧泡果酒发酵单因素试验

　　四个因素设定为：酵母接种量0.6%、主发酵温度26℃，初始糖浓度23%，初始pH4.3下主发酵12d，28℃后发酵30d;固定其中3个因素，依次探讨：酵母接种量(0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%)、主发酵温度(18℃、22℃、26℃、30℃、34℃)、初始糖浓度(19%、21%、23%、25%、27%)、初始pH(3.5、3.9、4.3、4.7、5.1)对果酒精度、酒总酸、可溶性固形物、pH的影响。

　　1.3.3正交试验

　　结合单因素试验结果，以酵母接种量、发酵温度、初始糖浓度、初始pH为因素，4个因素3个水平设计并进行L(934)正交试验，优化发酵工艺，其余步骤相同。

　　1.3.4测定方法

　　pH、酒精度的测定采用GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用的分析方法》进行[15];总糖的测定和标准曲线绘制[16]，得到标准曲线y=0.986x-0.0023，R2=0.9998;可溶性固形物、总酸(以酒石酸计)的测定则根据NY/T1508-2017《绿色食品果酒》进行[16];感官评价法：挑选10位选修过《感官评价》课程的食品质量与安全专业学生作为品尝者(5男5女)，对每一批果酒进行感官评定，品评杯为统一的玻璃酒杯，样品随机放置。品评者分别从色泽、香气、口感及状态方面对样品打分，评定标准参照国家标准执行[15]。

　　果酒挥发性物质检测交由昆明理工大学分析测试中心进行，程序和参数参考曾朝珍等[17]的研究进行设定：顶空进样，将1mL酒样与1mL甲醇混匀后加入50μL3-辛醇内标(630.8ppm)和100μL乙酸正戊酯内标(219.35ppm)，漩涡震荡后取1mL置于气相色谱瓶中自动进样。气相色谱条件为：250℃进样口温度，载气为氦气，流速为1.2mL/min，进样量为1μL，不分流。色谱升温程序为：40℃恒温2min，5℃/min升温至180℃，15℃/min速度升至250℃，保持5min。MS条件：EI电离子源，电子能量70eV，离子源温度为200℃，接口温度为250℃。扫描范围33.00～350.00amu。挥发性物质分析：化合物经计算机检索，与美国国家标准与技术研究院(NationalInstituteofStandardsandTechnology，NIST)的谱库相匹配，并分析可能属于栽秧泡果酒的风味物质，取匹配度≥80%的组分;峰面积归一化法计算各挥发性风味物质的相对百分含量。

　　1.4实验数据处理及分析采用Excel2016统计和作图，通过SPSS16.0进行数据分析。

　　2结果与分析

　　2.1单因素试验

　　2.1.1酵母接种量对栽秧泡酒发酵效果的影响

　　栽秧泡果酒的酒精度数随着酵母接种量的增加，呈现缓慢增大后迅速减小的趋势;葡萄酒-果酒专用酵母接种量过高或者过低都不利于酿酒酵母的发酵进程。接种量为0.4%时酒精度数最低为7.83±0.71%vol，可能是过多的酵母在生长阶段消耗了果汁中的大部分糖，导致酒精发酵阶段没有足够的糖可以被分解，从而影响了酒精含量。酵母接种量为0.7%时酒精度数最高，为10.30±0.05%vol，此时栽秧泡果酒的总酸为16.77±3.59g/L，可溶性固形物为7.17±0.13°Bx，pH为3.29±0.11。综合考虑选酵母接种量为0.6%、0.7%、0.8%进行正交试验。

　　2.1.2主发酵温度对栽秧泡酒发酵效果的影响

　　在主发酵温度为30℃时栽秧泡果酒酒精度和可溶性固形物均为最高，分别为10.05±0.06%vol和7.07±0.25°Bx;此时果酒的pH最低，为3.38±0.01。酒精度数随着主发酵 温度的升高总体呈现先升后降的趋势，在主发酵温度为18℃时酒精度数最低，仅为8.71±0.09%vol。综合考虑以主发酵温度为26℃、30℃、34℃进行正交试验。

　　3结论与讨论

　　3.1结论

　　本研究以栽秧泡果实为实验材料，以其果汁为发酵原液，通过单因素结合正交试验的方式对影响其果酒发酵的因素进行探讨并优化发酵工艺。确定了栽秧泡果酒的最适发酵条件为：酵母接种量0.7%，主发酵温度30℃，初始糖浓度25%，初始pH3.9，在此条件下住发酵12d以后，转入28℃恒温培养箱进行30d后发酵，所得栽秧泡果酒感官评分为92.10分，果酒酒精度数为11.46%vol，总糖3.89g/L，总酸13.04g/L，可溶性固形物7.64°Bx，pH为4.37;此时酒体呈金黄色，有淡淡的栽秧泡香，酸甜可口;栽秧泡果酒中相对含量较高的为醇类、酯类和酸类物质，共占总挥发性物质的79.29%，是构成栽秧泡果酒挥发性风味成分的主要基础物质。

　　3.2讨论

　　酵母接种量、主发酵温度、初始糖浓度和初始pH是影响果酒发酵的重要因素之一。酵母接种量不够时，酵母生长缓慢，发酵速度低，果酒易受杂菌感染;酵母接种过多则生长繁殖阶段消耗了果汁中的大部分糖，导致发酵阶段没有足够的糖可以被分解，从而影响了酒精含量。主发酵温度过低会抑制代谢有关的酶的活性，导致酵母对糖的利用率不高，发酵产酒速率较慢，甚至发酵不彻底;主发酵温度过高则发酵反应剧烈、酵母衰老速度加快、腐败微生物快速生长发育，致使果酒酒精度数下降[17]。

　　果汁中的糖分被分解为酒精等物质，适合的初始糖浓度在一定程度上能使酵母菌保持良好的繁殖和代谢速率[19];初始糖浓度过高则会影响酵母的生长繁殖[18]，同时过高的初始糖浓度还会增加发酵成本。果酒中的挥发性物质与果汁本身的挥发性物质和发酵过程中 微生物的代谢有关[20]。不同的发酵工艺参数则会导致代谢物的差异[21-22]。

　　目前，没有悬钩子果酒发酵专用酵母，现行的果酒发酵流程和评价标准也多以葡萄酒为参考。本研究未涉及菌种、后发酵时间、后发酵温度等同样会影响果酒品质的因素。如今有多种方法可以对果酒中的挥发性物质进行提取和检测：顶空-液相微萃取、顶空-固相微萃取、同时蒸馏萃取法、GC-MS、GC-FID等[19，23]。本研究采用的顶空固相(微)萃取因需样量小、重复性好、方便快捷等优点被广泛用于果酒挥发性物质的研究[9]。研究结果一定程度上填补了栽秧泡果酒发酵工艺的研究空白，为其果酒的规模化生产提供了参考。

　　参考文献：

　　[1]俞德浚，陆玲娣，谷粹芝，等.中国植物志[M].北京：科学出版社，1985.

　　[2]潘哲.栽秧泡繁殖特性及人工栽植方式的研究[D].北京林业大学，2014.

　　[3]SainiRT，DangwalK，SinghH，etal.AntioxidantandantiproliferativeactivitiesofphenolicsisolatedfromfruitsofHimalayanyellowraspberry(Rubusellipticus)[J].JournalofFoodScienceandTechnology，2014，51(11)：3369-3375.

　　[4]高辰哲，姜帆，王艳菲，等.响应面法优化红树莓酒发酵工艺[J].中国酿造，2016，35(12)：108-112.

　　[5]孙小华.无花果(FicuscaricaL.)果酒酿造工艺研究及抗氧化活性评价[D].东北农业大学，2018.

　　[6]郑万明.蓝莓果酒制备工艺优化研究[D].黑龙江大学，2018.

　　[7]刘慧，刘杰超，吕真真，等.加工工艺对蓝莓汁和蓝莓酒中花色苷及类黄酮的影响[J].中国酿造，2018，37(8)：158-162.

　　作者：宋志姣，周艺垠，郭燕，李悦，章金龙，李晓娇*