野生牛肝菌内生真菌分离鉴定及其生物学特性

　　摘要：采用组织分离法从黄皮疣柄牛肝菌、小美牛肝菌、双色牛肝菌的子实体中，分离纯化获得株内生真菌，经菌落、菌丝、孢子形态学观察及rDNAITS分子生物学鉴定，结果显示：菌株LCTG12为盖姆斯木霉Trichodermagamsii、LCCK为克鲁伊假丝酵母Candidakruisii、BSHC18为黄瘤孢菌Hypomyceschrysospermus、BBFO10为尖孢镰刀菌Fusariumoxysprum。对株内生真菌生物学特性进行研究，其中盖姆斯木霉菌丝生长速度较快，在CPDA培养基上，25℃培养5d菌丝长满平板;液态培养时，该菌株在25℃、摇床转速160r/min、pH5.5、8d，可获得菌丝干基生物量4.13g/L。平板对峙实验结果：盖姆斯木霉LCTG12对黄瘤孢菌BSHC18和尖孢镰刀菌BBFO10菌丝生长均有拮抗作用，并且，黄瘤孢菌BSHC18和尖孢镰刀菌BBFO10两者之间也具有拮抗作用，表明牛肝菌内生真菌中盖姆斯木霉对腐败菌具有拮抗作用，可为生物防腐提供优良的菌株。

　　关键词：野生牛肝菌，组织分离法，内生真菌，ITS分子鉴定

　　牛肝菌(Boletaceae是真菌界(Fungi)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricates)的大型真菌[1]，我国已知牛肝菌科有28属，397种及变种[2]，主要产地在云南。牛肝菌是一个复杂的生命体，其整个生命周期都伴随着内生真菌，内生菌之间可通过相互作用共同促进宿主的生长发育，也可与大型真菌的协同作用促进宿主产生更多的次生代谢产物。

　　生物真菌论文范例：构树叶投喂草鱼肠道真菌群落多样性研究

　　内生真菌(Endophyticfungi)定殖于健康的生物组织内部[3]，是构成菌物生态系统的天然组分。目前，具有抑菌、抗癌等活性的大量次生代谢产物从内生真菌中分离出来[47]，内生真菌将成为开发生物活性物质的资源宝库[8]。野生牛肝菌是优良的外生菌根真菌，其生长对寄主要求严格，大多数种类仍不能通过人工栽培形成子实体[910]，在野生牛肝菌子实体获得母种菌丝的分离过程中，研究明确与其内生真菌的关系，是获得原种、栽培种的基础，也是获得新的真菌资源途径之一。牛肝菌子实体含有大量人体必需氨基酸、矿物质、以及多种生物活性成分[1112]，具有降血脂、抗氧化、护肝、抗肿瘤、降血糖、清热解烦等功能[1317]。对于牛肝菌的研究主要集中在化学成分、生物活性等方面[1819]，而对于牛肝菌内生真菌的报道较少，丁小维等[20]从牛肝菌子实体中分离出毛霉属Mucorsp.)和黄瘤孢菌Hypomyceschrysospermus株内生真菌，并发现株内生真菌的发酵液都能抑制豆芽的生长。岳万松等[21]从种牛肝菌子实体中分离出株内生真菌，分别为毛栓菌Trameteshitsuta、假丝酵母属Candidasp.)、被孢霉属Mortierellasp.)、散囊菌属Eurotiumsp.)、金色毛壳菌Chaetomiumaureum。组织分离法是分离内生真菌的重要方法之一，本研究通过组织分离法从种新鲜野生牛肝菌中分离获得株内生真菌，结合菌株的形态特征和rDNAITS序列分析，对菌株进行鉴定，构建出系统发育树，并对几种内生真菌生长规律及内生真菌之间的拮抗关系等生物学特性进行研究，旨在为深入研究野生牛肝菌与内生真菌之间的关系进行初步探究，并为牛肝菌生长过程及采摘后的生物防腐提供优良的生防菌株，也可为开发新资源化合物提供菌种资源[2224]。

　　1材料与方法

　　1.1材料与仪器

　　鲜野生牛肝菌子实体：黄皮疣柄牛肝菌Leccinumcrocipodium(Letellier)watl.)、小美牛肝菌BoletusspeciosusFrost)、双色牛肝菌BoletusbicolorPeck)分别采摘于云南省楚雄彝族自治区禄丰县和南华县，无菌袋、冰袋封装，空运24h内分离。GK2043(胶回收试剂盒)GK1071(DNA提取试剂盒)引物ITS1和ITS4上海捷瑞生物工程有限公司合成。

　　固体培养基CPDA：马铃薯200g，葡萄糖20g，KHPO43g，MgSO·7HO1.5g，VB1mg，蛋白胨0.5，琼脂20g，水，pH自然(液态培养基去掉琼脂);固体培养基Pachlewski：葡萄糖20g，酒石酸铵0.5，KHPO41g，MgSO·7HO0.5g，VB0.1mg，琼脂20g，mL/L微量元素混合液(BO8.45mg，MnSO5mg，FeSOmg，CuSO0.625mg，ZnCl2.77mg，(NHMoO0.27mg)，去离子水1L;固体培养基MMN：NaCl0.025g，葡萄糖10g，KHPO40.5g，麦芽浸粉3.0g，VB0.1mg，CaCl0.05g，(NHHPO40.25g，琼脂20g，FeCl0.012g，MgSO·7HO0.15g;75%乙醇;JY300C电泳仪北京君意电泳设备有限公司;JY02G凝胶成像系统北京君意电泳设备有限公司;BeckmanJT25R高速冷冻离心机美国贝克曼库尔特有限公司;ABI3730测序仪北京东迅天地医疗仪器有限公司。

　　1.2实验方法

　　1.2.1野生牛肝菌内生真菌分离与纯化

　　将新鲜野生牛肝菌子实体用自来水冲洗数次，去除表面杂质，无菌水冲洗遍，75%乙醇漂洗2min，再用无菌水冲洗次，无菌纱布擦干子实体表面。采用组织分离法进行以下操作，用无菌解剖刀将牛肝菌子实体纵切开后，将内部的组织切割成0.5cm左右的小块，接种于CPDA培养基中，25℃恒温避光培养5d。待小块组织周围有内生真菌菌丝长出后，挑取少许菌丝，采用点植法纯化培养，转接次。共获得23株纯菌株，并移接至斜面试管4℃保存。

　　1.2.2野生牛肝菌内生真菌形态学鉴定

　　将23株真菌分别点植固体平板培养，挑选出形态、颜色有明显差异的菌落株，分别接种到CPDA固体平板上，25℃避光培养5d，观察菌落形态，显微镜观察菌丝及分生孢子颜色、形态，以十字交叉法记录菌落直径，且移接至斜面试管，待培养长出菌丝体后，4℃保存。

　　1.2.3基于rDNAITS序列分析的内生真菌分子鉴定

　　采用GK1071提取试剂盒，对株纯化菌株进行DNA提取。使用真菌ITS鉴定通用引物：ITS1：’TCCGTAGGTGAACCTGCGG’和ITS4：’TCCTCCGCTTATTGATATGC’对DNA的ITS片段进行PCR扩增。扩增体系为30µL反应体系，包括：10TaqBuffer3µL，dNTP1µL，Taq酶1µL，上游引物(10µmol/L)和下游引物(10µmol/L)各1µL，DNA模板2µL，ddH补足至30µL。

　　反应条件：预变性95℃，5min，95℃，15s，95℃，15s，95℃，45s，35个循环，72℃，5min保存。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳体系检测，采用凝胶成像系统观察结果。PCR扩增产物用胶回收试剂盒GK2043回收，送到上海捷瑞生物工程有限公司进行测序。将株内生真菌所测序列在GenBank中进行BLAST对比，选择同源性高于95%的序列，运用MEGA软件进行多重比较，通过NJ法构建系统发育树，并以bootstrap对发育树进行自举法检验1000次，从而确定菌株的亲缘关系及分类地位。

　　1.2.4液态发酵及干基生物量的测定

　　接种1cm菌丝块于装液量为80mL的250mL三角瓶中，在25℃，摇床转速160r/min，分别称量10d的生物量干重，每组设置个重复，将发酵液在5000r/min离心10min，收集菌丝体移至干燥皿中，置于70℃烘箱中，每隔1h取出称量，直到重量不再改变，即为生物量干重。

　　2结果与分析

　　2.1菌株的形态特征

　　从云南省个地区采摘的个种的野生牛肝菌子实体，共分离出可培养的内生真菌23株，通过菌落形态初步判断多数为木霉属，从中筛选出具有菌落形态、颜色、气味等差异大的株菌种，接种于CPDA培养基上，在25℃下培养5d，平板生长的菌落形态、光学显微镜观察的菌丝、孢子形态，利用MoticImagesPlus2.0软件进行显微形态(10×100)拍摄。

　　2.24种内生真菌菌株的系统发育树构建及分析

　　利用ITS通用引物(ITS1、ITS4)对株内生真菌进行序列扩增得到条基因序列，序列长度分别是LCTG12为620bp;LCCK为421bp;BSHC18为606bp;BBFO10为550bp。将以上条序列分别在NCBI库中进行在线BLAST比对，每种菌下载条同源性高于95%的序列，以测序得到的基因序列为基础，同公共数据库下载的相似序列合并，采用MEGA软件，按照neighborjoiningmethod(法)，经过自举法1000次进行检验构建系统发育树，以此对菌株进行种水平的分类鉴别。

　　株菌在NCBI中LAST比对结果显示：在100条序列比对结果中，LCTG12与76株木霉属序列Trichodermasp.)的序列同源性为99%以上，说明该菌为木霉属;LCCK与55株念珠菌属Candida的序列同源性为90%以上说明该菌为念珠菌属;BSHC18与50株菌寄生属Hypomycessp.)的序列同源性为90%以上说明该菌为菌寄生属;BBFO10与94株Fusariumoxysprum的序列同源性为99%以上。系统发育树树枝的长短表示各菌株之间的遗传距离，同一支说明亲缘关系很近，以系统发育方法可以对关系较为密切的菌株序列进行较好的判别。

　　结合形态学鉴定及BLAST对比及系统发育树结果：LCTG12与NCBI数据库中的Trichodermagamsii聚类在同一支上，自检支持率100%，鉴定该菌为盖姆斯木霉;LCCK与Candidakruisii聚类在同一支上，自检支持率为100%，鉴定该菌为克鲁伊假丝酵母;BSHC18与Hypomyceschrysospermus聚类在同一支上，自检支持率为100%，鉴定该菌为黄瘤孢菌;BBFO10与Fusariumoxyspru聚类于同一株上，自检支持率达100%，鉴定该菌为尖孢镰刀菌。

　　2.3野生牛肝菌内生真菌的生物学特性

　　2.3.1种培养基对内生真菌生长速度的影响为掌握株内生真菌(LCTG12、LCCK、BSHC18、BBFO10)的生物学特性，选择CPDA、Pachlewski、MMN为供试培养基，研究种培养基对菌丝生长速度的影响，25℃培养，在cm的平板上采用十字交叉法测量菌落直径，结果如图所示。由图可知，在培养第4d时进行菌落直径测量，PDA上的生长速度明显优于其他种培养基，内生真菌LCTG12培养5d，LCCK培养6d，BSHC18培养7d，BBFO10培养8d可长满平板，故选择CPDA培养基为种内生真菌的最适培养基。

　　结论

　　目前对于牛肝菌中的内生真菌报道较少，为探究野生牛肝菌中内生真菌资源，及分析其内生真菌间是否存在拮抗关系，本文以种新鲜野生牛肝菌子实体为分离材料，经过组织分离纯化共得到23株纯菌株，从中筛选出株具有典型特征的纯菌进行形态观察和ITSrDNA现代分子生物学鉴定，鉴定出内生真菌LCTG12为盖姆斯木霉Trichodermagamsii;LCCK为克鲁伊假丝酵母Candidakruisii;BSHC18为黄瘤孢菌Hypomyceschrysospermus;BBFO10为尖孢镰刀菌Fusariumoxysprum，并对几种内生真菌生长规律及内生真菌之间的拮抗关系等生物学特性进行研究。

　　得出结论：CPDA培养基较适合这株菌的生长，其中盖姆斯木霉的生长速度较快，5d即可长满9cm的平板，其余种菌株长满板的时间分别为6、7d、8d，并且盖姆斯木霉对黄瘤孢菌和尖孢镰刀菌菌丝生长均有拮抗作用，黄瘤孢菌和尖孢镰刀菌两者之间也具有拮抗作用。

　　牛肝菌等大型真菌生长过程中会出现腐败菌导致其菇体腐烂和根腐病[2628]，且内生真菌的次级代谢产物丰富[290]，故进一步研究其内生真菌能够产生结构新颖、活性广泛的次级代谢产物对新型药用资源开发具有重要的意义。本文旨在为深入研究野生牛肝菌与内生真菌之间的关系进行初步探究，并为牛肝菌生长过程中可能出现的病害及采摘后的的生物防腐提供优良的生防菌株。

　　参考文献：

　　[1]卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州:河南科学技术出版社,2000:315.MaoXL.Chinesemacrofungi[M].Zhengzhou:HenanScienceandTechnologyPress,2000:315.

　　[2]李泰辉宋斌中国牛肝菌已知种类[J].贵州科学2003,31):7886.LiTH,SongB.oletespeciesknownfromChina[J].GuizhouScience,2003,31):7886.

　　[3]PetriniO.Fungalendophytesoftreeleaves[C]//AndrewsJH,HiranoSS,eds.Microbialecologyofleaves.NewYork:SpringerVerlag,1991:179197.

　　作者：徐伟，张雪，王植朔，谢红瑶，吴凡，邵百琪