构树叶投喂草鱼肠道真菌群落多样性研究

《构树叶投喂草鱼肠道真菌群落多样性研究》论文发表期刊：《基因组学与应用生物学》；发表周期：2020年08期

《构树叶投喂草鱼肠道真菌群落多样性研究》论文作者信息：周本翔 1,2 赵良杰 1,2 彭新亮 1* 1 信阳农林学院水产学院, 信阳, 464000; 2 河南省渔业生物工程技术研究中心, 信阳, 464000 周本翔, 赵良杰, 彭新亮, 2020, 构树叶投喂草鱼肠道真菌群落多样性研究, 基因组学与应用生物学, 39(8): 3453-3460

　　摘要为研究不同饲料对草鱼肠道真菌多样性的影响，本研究采用高通量测序技术对投喂构树叶和配合饲料的草鱼肠道的真菌多样性进行比较分析。结果显示，配合饲料组的真菌群落多样性高于构树叶组。真菌序列共聚集成1330个OTU，其中942个OUT可归入子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和球囊菌门(Glomeromycota)5个门。子囊菌门和担子菌门是两实验组的主要优势类群。群落结构分析显示，构树叶组和配合饲料组肠道真菌群落结构有明显差异，表明草鱼肠道真菌物种组成受到食物改变的影响明显。

　　关键词 构树叶，肠道，草鱼，真菌

　　Abstract In order to study the effects of different feeds on the diversity of intestinal fungi in grass carp, High-throughput technique was used to analyze the diversity of intestinal fungal community of grass carps fed with Broussonetia papyrifera leaves and formula feed. The results showed that the diversity of fungal community in the compound feed group was higher than that in the Broussonetia papyrifera group. The fungal sequences clustered into 1 330 OTU, and among them, 942 OUT can be classified into five phyla: Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota, Chytridiomycota and Glomeromycota. Ascomycota and basidiomycota were the dominant groups in the two groups. Community structure analysis showed that there were significant differences in the community structure of intestinal fungi between the Broussonetia papvrifera leaves group and the formula feed group, and the species composition ofintestinal fiungi in grass carp was significantly affected by food changes.

　　Keywords Broussonetia papyrifera leaves, Intestinal, Grass carp, Fungus

　　草鱼(Cenopharyngodon idellus)属于鲤形目(Cypriniformes)、雅罗鱼亚科(Leuciscinae)、草鱼属(Genopharyngodon)，是中国主要的淡水养殖经济鱼类之一。该鱼为草食性，具有生长迅速、易饲养产量高等特点，是中国大宗淡水鱼中养殖范围最广、产量最大的养殖品种、年产量约占中国淡水鱼总产量的20%(毕香梅等，2011)，2017年全国草鱼产量达5.3456x109kg草鱼为典型的草食性鱼类，传统养殖方式多采用打捞水草或人工种植牧草等青饲料养殖。随着劳动力成本的上升和饲料工业的快速发展，为追求养殖产量和高效，传统草鱼养殖模式被高投入，高产出的配合饲料养殖模式代替。但利用配合饲料高投入养殖的草鱼极易出现病害频发，肌肉品质下降，口味较差等问题。研究表明，用青饲料饲养的草鱼不仅肉质鲜美，氨基酸组成更合理(毕香梅等，2011)，养殖水体的微生物多样性也显著高于配合饲料(罩雅，2016)

　　因此，近年来积极提倡多种回归青饲料的草鱼健康养殖模式，并取得了不错的经济和生态效益(张德凤，2018，科学养鱼(7)22-3;吴良成等，2013，河南水产，(4)：29-30)

　　构树叶是一种营养丰富的高蛋白青饲料，蛋白质含量为其干质量的21.30%-22.97%(邳植和沈世华，2018)，构树叶用于畜禽养殖需要发酵处理才能被较好地吸收利用(李海新，2010;熊罗英等，2012，饲料研究，(5)：51-54)，构树叶养殖草鱼则可直接投喂，经草鱼初步消化后的粪便在水中微生物和原生动物的作用下形成生物絮团，不仅能被草鱼再摄食利用，也是链、鳍、鲤、鲫等滤食性和杂食性鱼类的饵料，构树叶养殖草鱼这种简便且高效的利用方式是畜禽养殖无法达到的。近年来，本项目组一直在进行构树叶养殖草鱼的提质增效技术探索，发现利用构树叶主养草鱼不仅疾病发生少，成活率高，还有效带动其他鱼的生长，可明显提高产量和效益(周本翔，2018，科学养鱼，(6)：79-80)。

　　动物肠道内分布有细菌、真菌、古菌和病毒等大量的微生物，这些微生物在宿主的生长、发育、免疫及营养吸收利用等方面发挥着重要作用，其中真菌是肠道微生物的重要组分，其群落结构组成受食物、品种、药物、疾病等多因素的影响(朱文华和吴本俨，

　　2017)。研究发现，食物是影响鱼类肠道菌群的主要因素之一(Wanget al，2018)。为探讨构树叶对草鱼肠道真菌多样性的影响，本研究选取新鲜构树叶，并以传统牧草及配合饲料作为对比，利用高通量测序技术

　　(llumina Miseq")比较研究构树叶对草鱼的肠道真菌群落的组成及多样性变化的影响，以期为草鱼的构树叶健康养殖提供基础资料和理论依据。

　　1结果与分析

　　1.1实验鱼的解剖观察

　　对3组实验鱼进行解剖观察发现，3个饲料投喂组鱼类肠道在投喂1h以上均较为丰满，充塞度高，表明实验前期驯食效果良好。观察发现，经过3周不同饲料的投喂，投喂构树叶组和牧草组实验鱼体内脂肪含量明显较少，肝胰脏呈现紫红色，富有弹性，压迫无凹陷：投喂配合饲料组实验鱼体内脂肪较多，肝胰脏呈黄白色，弹性较差，易碎。经测量，各组实验鱼体长、体重和空壳重均无明显差异。

　　1.2真菌高通量测序基本情况对样品的DNA质检发现投喂牧草组肠道样品的总DNA中，真菌DNA含量较低，PCR扩增成功率很低，无法达到实验要求，因此未对该组样品进行高通量测序。投喂构树叶和配合饲料组实验鱼的肠道内含物中PCR检测到较为丰富的真菌DNA(图1)，对构树叶组和配合饲料组实验鱼的肠道真菌多样性开展测序。测序数据经质控、去除嵌合体和非特异性扩增序列，18个样品共计获得1 004470条有效分析序列，经聚类合并共得到1330个操作分类单元(0-

　　TU)分类。

　　1.3多样性分析

　　通过单样品的Alpha多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性。ACE指数和chao1指数均是用来估计群落中含OTU数目的指数，在本研究中是对肠道内含物中真菌群落丰度的反映。可以看出各个样品中真菌群落的丰度无显著的规律性，并未因为饲料种类的不同和肠道位置的不同而有明显的改变。Shannon指数和Simpson指数显示，配合饲料组的真菌群落多样性高于构树叶组。而从肠道位置看，在构树叶组中1号实验鱼中肠的真菌群落多样性低于前肠和后肠，另外两组实验鱼均是中肠的真菌多样性要高于前肠和后肠。配合饲料组的3尾实验鱼中肠真菌多样性均低于前肠和后肠。

　　1.4物种组成及优势类群分析

　　1330个OTU有942个可以归入子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)以及球囊菌门(Glomeromycota)5个门，其余388个未能确定物种分类归属。在可以确定物种的942个OTU中，子囊菌门(Ascomycota)数量最多，共有761个OTU归入该门，另有145个OTU属于担子菌门(Basidiomycota)

　　物种，其他各门物种数量较少，子囊菌门和担子菌门

　　物种是所有样品中的主要优势类群。分别对两个实验组的OUT按照相对丰度进行排序，发现配合饲料组草鱼肠道内含物比例大于1%的真菌优势菌群

　　有21个：构树叶投喂组大于1%的真菌优势菌群有16个。两组共同的优势真菌为4个，分别为皱枝孢

　　(Cladosporium delicatulum)菌株(OTU2 129，OTU2324)

　　一种未知真菌(OTU1857)、散子囊菌目物种Eurotiales sp.(OTU1514)(图2;表2)。

　　1.5群落结构分析

　　基于群落结构数据进行UPGMA聚类分析、NMDS非度量多维尺度分析、PCoA分析，观察发现，在上述分析图中(图3;图4;图5)，G组和s组都自成区域，均可以将两个饲料投喂组的草鱼肠道真菌群落清晰地分开，但是无论在组内还是组间，均不能够清晰地界定草鱼前、中、后肠的真菌群落差异。表明不同真菌群落的多样性受到了不同饲料投喂的影响而表现出差异性。

　　2讨论

　　本研究3组实验鱼经3周不同饲料投喂后，解剖发现，投喂1h后草鱼肠道均较为丰满，充塞度高，说明构树叶对草鱼适口性较好，适合喂养草鱼。虽然各组实验鱼体长、体重和空壳重均无明显差异，但构树叶组和牧草组与配合饲料组鱼的肝胰脏颜色和质地则有明显差异，构树叶组和牧草组肝胰脏为紫红色，富有弹性，压迫无凹陷，配合饲料组肝胰脏呈黄白色、弹性较差、易碎。

　　肝胰脏作为水产动物新陈代谢最活跃的器官之一，其颜色和质地常作为鱼机体健康的重要指标。草鱼的肝胰脏营养健康评价标准为：健康草鱼的肝胰脏颜色为紫红色，质地富有弹性，压迫时无凹陷：不健康草鱼的肝胰脏颜色变淡、发白无血色、变黄、变绿、质地差、易碎(刘猛，2013)。根据草鱼的肝胰脏营养健康评价标准可知，投喂构树叶和牧草青饲料有利于保持草鱼的健康，而配合饲料则不利于草鱼的健康生长。

　　相比肠道细菌，真菌的丰度和多样性较低且组成不稳定(Heather et al，2015;Suhr et al，2016)，通用引物PCR扩增真菌DNA常出现阴性。本研究对牧草组肠道样品质检发现真菌DNA含量较低，PCR扩增无法达到实验要求，因此未进一步对该组样品进行高通量测序。对构树叶和配合饲料组肠道样品进行测序，Alpha多样性分析表明，Shannon指数和Simpson指数均显示配合饲料组的真菌群落多样性高于构树叶组。研究发现，健康肠道中真菌菌群所占比例极小，约占黏膜微生物总量的0.02%(Hebuterne et al.，2014)一些真菌会为致病菌的生长提供支持和保护作用，如地丝菌属可促进沙门氏菌的生长(Wade et al，2003)，白色念珠菌可促进金黄色葡萄球菌生物膜的形成(Harriott and Noven，2009)，肠道中真菌菌群多样性的增加会增加宿主致病的风险(车媛和李秋荣，2016)，炎症性肠病肠黏膜真菌的丰度及多样性较健康肠道明显升高(Ott et al，200)本研究配合饲料组草鱼肠道的真菌多样性高于构树叶组，推测投喂构树叶比配合饲料更有利于草鱼的健康生长，这也与草鱼肝胰脏营养健康评价标准相一致。对实验鱼前、中、后肠分析显示，构树叶投喂组真菌多样性无明显的空间变化规律;而在饲料投喂组中，3个样本中肠的真菌多样性均低于前肠和后肠。这一结果可能由于构树叶组的肠道真菌多样性总体较低，物种丰度有限，因此并未显示出明显的规律性;而饲料投喂组真菌多样性总体较高，处于主要食物消化区域的中肠，由于受到消化液等的影响，真菌的生长受到抑制，多样性较低。

　　物种组成分析显示，真菌序列共聚集成1330个OTU，有942个OUT可确定物种分类归属，他们可归入5个门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、接合菌门(Zygomycota)以及壶菌门(Chytridiomycota)，其中子囊菌门(Ascomycota)数量最多(761个OTU)，其次为担子菌门(Basidiomycota)(145个OTU)，两门真菌是所有样品中的主要优势类群，本研究与人(Heather et al.，2015)、马(邢振存，2016)和鸡(温雪婷等，2019)的肠道优势真菌组成相一致。对构树叶组和配合饲料组进行共同优势真菌菌群分析发现，皱枝孢(Cadasporium delicatulum)菌株(OTU2129，OTU2324)为两实验组共同的优势真菌菌群。有报道显示，枝孢属(Cladospori um)一些物种可以产生木质素酶和纤维素酶(靳冉，

　　2012)，在霉树叶中也分离到该种真菌，该属另外一些物种还出现在食草动物的粪便中(张中义和孔华忠，2000)。本研究中该种作为优势种同时出现在两个实验组中，推测该种可能与草鱼肠道内植物源性碳源的利用有关。

　　基于群落结构的统计分析(聚类分析，NMDS分析和PCoA分析)均显示构树叶和配合饲料投喂组肠道真菌群落结构有明显差异，表明真菌物种组成受到食物改变的影响明显，通过对肠道真菌群落的分析，可以反映其食物的明显差异。

　　3材料与方法

　　3.1实验材料

　　本实验草鱼来自罗山县小龙山鱼类良种繁育场，平均体长规格(14.5+2.9)cm，均为亚成体，实验用鱼体质健康，水族箱中进行训食反应良好。实验前，采用膨化颗粒浮性配合饲料饲养5周，将鱼随机分为3组，分别用新鲜构树叶(G组)、配合饲料(s组)及新鲜牧草(C组)进行训食，训食稳定后，分别连续用上述3种饲料饲养3周，不同饲养组鱼缸之间养殖用水通过大循环过滤相联系，以此保证养殖水环境的一致性。养殖实验3周后，于最后一次投喂后1-2h内，对草鱼肠道内含物进行取样。取样时，先破坏鱼的中枢神经系统处死，对鱼进行解剖，观察鱼内脏器官状态、消化道充塞度等，清理出肠道，并分别截取前、中、后肠取内含物于灭菌离心管中充分混匀，置于-80℃冰箱保存备用。样品编号为G1-1，G1-2、G1-3分别代表构树叶组1号鱼前肠、中肠、后肠，以此类推。

　　3.2样品预处理和总DNA提取

　　称取200 mg的样品，放入灭菌的2mL离心管中，加入1 mL70%乙醇，震荡混匀，离心机离心3 min，转速10000/min，倒去上层液体保留沉淀。加入1x PBS溶液，震荡混匀，再次在室温下离心3 min，转速10 000 rmin室温离心3min，倒去上层液体保留沉淀。将2mL离心管倒置于吸水纸上，尽量除去液体。将处理后的样品放入55℃鼓风干燥箱烘干10 min，直至残留酒精彻底挥发完全，以保证后续实验操作。采用OMEGA公司生产的试剂盒(型号E.Z.N.AM Mag-Bind Soil DNA Kit)进行草鱼肠道内含物样品总DNA的提取。

　　3.3 ITS序列扩增

　　利用定量检测试剂盒(型号Qubit 2.0 DNA)对基因组DNA进行精确定量，根据检测结果确定PCR反应的模板DNA添加量。使用引物ITS1-2通用引物(TTSI引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN

　　(barcode)CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，ITS2Rev引物：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATG)进行第一轮PCR扩增。PCR反应体系：2xTag Master Mix用量为15 uL，正反向引物Bar-PCR primer F(10 umil/L)和Primer R(10 umil/L)用量分别为1uL，模板DNA用量为20 ng，灭菌纯水补足，总反应体积为30 L PCR反应条件依次为：94℃持续3min预变性：94℃变性30 s，45℃退火20s，65℃延伸30 s，以上3步执行5个循环：94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30s，以上3步执行20个循环：72℃持续5min终延伸。随后，使用Ilumina桥式PCR兼容引物进行第2轮PCR扩增。使用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测及纯化回收。

　　3.4高通量测序及数据质控

　　采用Miseq测序平台对扩增文库进行双末端测序，对测序得到的结果进行数据质量控制。去除引物接头序列，将成对的Reads进行配对拼接(Merge)，按照Barcode序列区分样品进行归类，通过识别和去除嵌合体以及非特异性扩增等情况，对数据进行过滤和质量控制，最后得到符合分析要求的数据集合。

　　使用Usearch软件对各样品序列进行序列相似性比对及操作分类单元(OTU)归类，后续生物信息统计采用97%相似度水平(属级)下得到的OUT进行分析。

　　3.5生物学数据分析

　　对各样本得到的OTU序列进行分类比对鉴定，获得物种信息。对两个实验组的优势类群和优势OUT分类单元进行分析，比较各样品的物种组成情况及差异。采用Chao指数和ACE指数对群落分布丰度进行评价，估计群落中含OUT的数目。采用Shannon index.Simpson index和Coverage指数评价草鱼真菌群落分布多样性(Community diversity)。群落结构采用柱状图进行描述，表示各样品中不同真菌操作分类单元所占百分比。

　　为了解各样品真菌群落结构的分组相关关系，分别采用UPGMA聚类分析、NMDS非度量多维尺度分析、PCoA分析对群落结构数据进行统计。UP.GMA聚类分析首先利用层次聚类(Hierarchical cluatering)对多样性距离矩阵进行分析，再进行树状结构构建(Unweighted pair group method with arithmetic mean，非加权组平均算法UPGMA)，绘制树状图用于分析：利用样品中物种组成和丰都等群落信息进行非度量多维尺度分析(NMDS)，绘制二维坐标图，样品以点的形式出现在图上，点之间的相互关系以距离体现，以此来判断群落间的相似程度。PCoA(Pincipal co-ordinates analysis)是一种研究群落结构差异的可视化降维分析方法，对样品进行降维后获取各样点的主成分因子，利用因子得分得到的特征值在坐标系中对样点进行空间排序，同样以点之间的距离关系来分析群落间的相似程度。

　　作者贡献

　　周本翔负责数据分析和论文撰写;赵良杰负责样品处理和实验工作;彭新亮和赵良杰负责总体实验设计和研究指导工作。全体作者都阅读并同意最终的文本。

　　致谢

　　本研究由河南省科技攻关计划(农业领域)项目(172102110127)和河南省科技攻关项目(182102110081)共同资助资助。

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