不同来源沙门菌的分子分型及耐药性研究

《不同来源沙门菌的分子分型及耐药性研究》论文发表期刊：《中国病原生物学杂志》；发表周期：2020年10期

《不同来源沙门菌的分子分型及耐药性研究》论文作者信息：【通讯作者】巢国祥祥 【作者简介】徐红红（1995-），女，山东烟台人，硕士研究生在读，主要从事分子流行病学研究.

　　【摘要】目的 对272株不同来源的沙门氏菌进行血清型、MLST和药敏试验，分析沙门菌的流行和耐药情况，为疾病的预防和临床用药提供科学依据。方法对不同来源沙门菌进行血清型鉴定和MIST分型，用MEGA5进行溯源分析，对15种常见抗生素进行药物敏感试验。结果 272株沙门菌分为19种血清型、26种ST型和4个同源复合体(CC11.CC64.CC19.CC68)，ST11(肠炎沙门菌)、ST17(印第安纳沙门菌)、ST40(德尔卑沙门菌)、ST19(鼠伤寒沙门菌)

　　和ST34(鼠伤寒沙门菌)为主要克隆。肠炎、鼠伤寒和德尔卑沙门菌是人和动物中常见血清型，印第安纳沙门菌在鸡中的携带率为33.64%，每个同源复合体都有其独特的地区分布。人源与动物源沙门菌耐药情况相关。多重耐药菌主要包括肠炎、印第安纳、德尔卑、鼠伤寒和汤卜逊沙门菌，并对氨苄西林表现出较高的耐药。印第安纳沙门菌对9种及以上抗生素耐药。结论 沙门菌血清型和ST型有高度的相关性。人源和动物源沙门菌的耐药性存在明显的相关性。耐药表型在血清型上存在差异，由鸡携带的印第安纳沙门菌是一种泛耐药克隆。

　　【关键词】沙门菌;血清型;多位点序列分型;多重耐药

　　【Abstract】 Obiective In order to provide a scientific basis for the prevention and clinical treatment of salmonellosis.

　　the prevalence and antimicrobial resistance of 272 Salmonella isolates from different sources with serotypes were analvzed and subjected to, MLST and resistance testings. Methods The serotypes and MLST types of Salmonella from different sources were identified, MEGA5 was used for traceability analysis, and their resistance to 15 antibiotics was determined.

　　Results The 272 isolates of Salmonella included 19 serotypes. 26 ST types. and 4 homologous complexes (CC11.CC64. CC19, and CC68), ST11 (S. enteritidis), ST17 (S. indiana), ST40 (S. derby), ST19 (S. typhimurium).

　　and ST34 (S. typhimurium) were the predominant clones. S. enteritidis, S. typhimurium, and S. derby were the predominant serotypes in humans and animals, S, indiana was carried by 33.64% of chickens. Each clonal complex had its own unique regional distribution. There was a correlation between resistance characteristics of human and animal-derived isolates. The multi-drug resistant bacteria mainly included S. enteritidis. S. indiana. S. derby. S. typhimurium, and S. thompson, which were highly resistant to am picillin, S. indiana isolates were resistant to 9 or more antibiotics.

　　Conclusion There was a high correlation between the serotype and ST type. There was a clear correlation between resist-

　　ance characteristics of human and anima-derived isolates. Obvious differences in resistance profiles were evident between the serotypes. Carried by chickens. S. indiana isolates were highly drug-resistant, producing a highly resistant clone.

　　【Key words】 Salmonella; serotype; multilocus sequence typing; multi-drug resistance

　　**沙门菌(Salmonella)是自然界中普遍存在的人畜共患致病微生物，不仅引起家禽的各种疾病，还能通过污染的肉类、禽蛋类、蔬菜等食物经粪口途径传播给人类[1]。其血清型种类众多，不同血清型对人和动物的致病性不同[2]，全球每年有9380万人因感染沙门菌引起腹泻[3]。不同地区和宿主的优势血清型不同，在不同宿主之间进行水平传播，并且在人类沙门菌的感染和家禽消费之间已经建立了联系。多位点序列分型(MLST)具有高分辨、可追溯和阐述细菌之间的进化关系等优点，以选定的等位基因序列分析为基础，从分子流行病学的角度发现、追溯和评价新出现的病原菌]。抗生素在临床和畜牧业上的广泛使用和溢用，促进了沙门菌耐药性的产生，尤其是多重耐药(MDR)

　　沙门菌的出现[。印第安纳沙门菌成为我国沙门菌主要血清型之一，对几种常见的抗生素产生耐药.-，引起广泛关注。

　　本研究对不同来源沙门菌进行血清分型及MLST分型，并检测其对9类15种常见抗生素的耐药性，以期了解江苏省不同地区和不同宿主沙门菌的血清型、ST型分布及耐药状况，并进行沙门菌的溯源分析，为沙门菌流行病学及其防控措施研究提供数据支持。

　　材料与方法

　　1材料

　　1.1 菌株 沙门菌272株，包括来自于江苏省(盐城、扬州、徐州、镇江、南通、无锡、苏州、常州、宿迁和南京)

　　的人源沙门菌83株(分离自食品相关从业人员、食源性疾病患者和腹泻病患者)，食源沙门菌21株(分离自市场所售肉类和餐馆食品)，鸡源沙门菌110株(分离自养殖场中肉鸡、蛋鸡、宰杀前活体和腿毛和整禽等)，猪源沙门菌51株(分离自猪胴体、鼻拭子和肛拭子等)和外环境沙门菌7株(分离自养殖场的粪便和土壤)

　　以上菌株均于2015-2018年间收集，并通过生化试验确认为沙门菌。大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC29213质控菌株为本室保存。

　　2方法

　　2.1 血清型鉴定 参照GB47894-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门菌检验方法，用玻片

　　凝集法进行血清型鉴定。

　　2.2 MLST分型 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，用针对7个管家基因areC，thrA，purEdnaN，sucA.hisD和hemD设计的引物进行PCR扩增，扩增程序和引物参见MLST数据库详细说明.对扩增产物测序，测序结果采用DNAStar软件根据PubMLST的相关要求修正，与MLST数据库中序列进行比对分析，获取7个管家基因位点的等位基因数值和ST型。

　　2.3 系统发育分析 每个基因位点和每个ST对应

　　的7个基因位点的连锁序列最小进化树(ME)由MEGA5软件生成，每个位点核苷酸的变异及其各自

　　的标准误差均由MEGA5确定。

　　2.4 药敏试验 抗生素药物敏感性试验采用纸片扩散法(Kirby-Bauer)，选用以下15种抗生素进行试验：

　　1)青霉素类，包括氨苄西林(AMP，10 1g)、阿莫西林(AMC.30 pg);2)11代头孢菌素类的头孢西丁(FOX.30 pg);3)11代头孢菌素类，包括头孢噻肟(CTX，30pug)、头孢派酮(CFP，35 1g)、头孢曲松(CRO，30 ug);

　　4)IV代头孢菌素类的头孢呲肟(FEP，30 pg);5)氨基糖苷类，包括庆大霉素(GM，10 1g、卡那霉素(K，301ug)、阿米卡星(AK.30 ug);6)喹诺酮、氟喹诺酮类包括萘啶酸(NA.30 pg)和环丙沙星(CIP.5 4g);7)磺胺类的磺胺甲恶唑(SXT.25 ug);8)氯霉素(C.30 1g);

　　9)四环素(TE，30 1g)，结果判定参照CLSI的药物敏感试验指南。耐3类及以上抗生素的为多重耐药菌(MDR)，耐9种及以上抗生素的菌株为泛耐药菌(XDR)[72.5 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料的比较采用x2检验，并进行Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　结果

　　1沙门菌的血清型

　　272株不同来源沙门菌经鉴定分为19种血清型，常见的是肠炎沙门菌(92株)、印第安纳沙门菌(45株)、德尔卑沙门菌(34株)和鼠伤寒沙门菌(32株).

　　人源分离株主要为肠炎沙门菌(23株)、鼠伤寒沙门菌(20株)和德尔卑沙门菌(7株);鸡源分离株主要为肠炎沙门菌(59株)和印第安纳沙门菌(37株);猪源分离株主要为德尔卑沙门菌(23株)、鼠伤寒沙门菌(10株)

　　和猪霍乱沙门菌(10株).

　　2 MLST分型

　　272株沙门菌鉴定出26种ST型，主要包括ST11(95株)、ST17(45株)，ST40(30株)、ST19(20株)、ST34(10株)和ST68(8株)，合计占总分离株的76.47%(208/272)，ST11包括肠炎沙门菌(92株)和都柏林沙门菌(3株)，ST17为印第安纳沙门菌(45株)，ST40包括德尔卑沙门菌(28株)、鼠伤寒沙门菌(1株)和阿贡纳沙门菌(1株)，ST19为鼠伤寒沙门菌(20株)，ST34包括鼠伤寒沙门菌(9株)和伤寒沙门菌(1株)，ST68全部为猪霍乱沙门菌(8株)，ST319为汤卜逊沙门菌(7株)，采用MEGA5软件绘制最小进化树(图1)，得到4个同源复合体C11.CC64，CC19和CC68，其中，CC11主要来自于徐州，CC19主要来自于镇江，CC68主要来自于扬州。CC11(100株)包括ST11(95株)和ST92(5株)，CC19(31株)包括ST19(20株)，ST34(10株)和ST1544(1株)，CC64(10株)包括ST64(5株)和ST2441(5株)，CC68(10株)包括ST68(8株)，ST139(1株)和ST145(1株)。

　　3沙门菌抗生素耐药表型81.62%(222/272)的沙门菌对至少1种抗生素耐药，以对萘啶酸71.32%)、氨苄西林(56.99%)、四环素(53.68%)和头孢派酮(40.44%)的耐药率最高;其次是氯霉素(33.46%)、磺胺甲恶唑(33.09%)、卡那霉素(29.41%)、头孢噻肪(21.32%)、庆大霉素

　　(20.96%)、环丙沙星(20.22%)、头孢曲松(19.85%)阿莫西林(17.65%)、头孢吡肟(14.71%)、阿米卡星(14.71%)和头孢西丁(2.57%)。鸡源沙门菌对头孢派酮、头孢噻肟、环丙沙星、头孢曲松和头孢吡肟的耐药率分别为68.18%，41.82%，34.55%、42.73%和29.09%，猪源沙门菌对上述抗生素的耐药率分别为15.69%.9.80%.9.80%.3.92%和3.92%，人源沙门菌对上述抗生素的耐药率分别为18.07%，4.82%、7.23%.3.61%和3.61%，对鸡源与人源沙门菌耐药情况进行相关性分析，Pearson相关性系数为0.850(P<0.05)，猪源与人源沙门菌Pearson相关性系数为0.857(P<0.05).

　　63.30%(173/272)的菌株是MDR克隆，包括肠炎、印第安纳、德尔卑、鼠伤寒和汤卜逊沙门菌(表1).肠炎沙门菌对氨苄西林和头孢派酮的耐药率分别为72.36%和49.47%(表2).11株分离于鸡的耐药模式与人源分离株相同，60.00%(50/92)菌株对3或4类抗生素耐药，耐药谱为AMP-NA-TE(16株)、AMP-

　　CFP-NA(11 株)和 AMPCFP-NA-TE(21株)，3.26%

　　(3/92)的菌株对9到14种抗生素耐药(表1)。印第安纳沙门菌对阿莫西林、头孢噻肟、头孢派酮、头孢曲松、头孢吡肟、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、环丙沙星和氯霉素的耐药率与其它克隆(肠炎、德尔卑和鼠伤寒沙门菌)相比差异有统计学意义(P<0.05)且耐药率均高于其它克隆，除头孢西丁外，对其它抗生素的耐药率均>60.00%，并且对氨苄西林、氟喹诺酮和第三代头孢菌素耐药率均> 80.00%(表2)，97.78%(44/45)的菌株为MDR.86.67%(39/45)的菌株为XDR.汤卜逊沙门菌中有1株菌对15种抗生素全部敏感，其它菌株对氨苄西林、头孢噻肟、头孢派酮、头孢曲松、卡那霉素、阿米卡星、萘啶酸和氯霉素都产生耐药性，85.71%(6/7)的菌株为MDR，42.86%(3/7)为XDR(表1)。鼠伤寒沙门菌对氨苄西林的耐药率为54.54%，9.39%(13/33)为MDR，12.12%(4/33)为XDR(表1)，德尔卑沙门菌对四环素和氨苄西林的耐药率分别为85.29%和32.35%(表2)，并且猪源和人源沙门菌对四环素的耐药率分别为95.65%(22/23)和57.14%(4/7)，耐药谱种类分散，70.59%(24/34)的菌株为MDR，2.94%(1/34)的菌株为XDR(表1).

　　讨论

　　沙门菌血清型呈多态性，肠炎、印第安、鼠伤寒和德尔卑沙门菌为优势血清型。人感染沙门菌可由家禽传播引起。肠炎、鼠伤寒和德尔卑沙门菌是人和家禽

　　(包括鸡或猪)感染的常见血清型[10，这些血清型经常与人类疾病暴发和零星病例有关[1-1，德尔卑沙门菌也是中国从婴幼儿中分离出最常见的血清型之一。印第安纳沙门菌在鸡中携带率高，并且鸡肉产业供应链的每一个环节都能检测到，在这种动物和它的生产环境建立起联系，因此推测该血清型的宿主为鸡。近年来这种血清型从人群中分离出的菌株逐渐增加，特别是家禽从业者[，但是没有确凿的证据表明该血清型在食用动物中流行率的增加与人类感染这种沙门菌的增加之间存在联系。

　　沙门菌的基因克隆具有多样性，ST11，ST17

　　ST40，ST19，ST34和ST68是常见的克隆，CC11和CC19是两个主要的同源复合体，每种主要的ST克隆都有各自紧密对应的血清型，反映了某些用于MLST分型的基因与细菌血清学分型相关的表型特征有关[5]，且每个同源复合体都有独特的地区分布[1]，表明在传播过程中沙门菌也在进行着进化和变异，这与沙门菌在适应动物内环境和外环境的过程中管家基因的点突变有关，因此亲缘关系较近的ST型血清型也相似，如CC19中的ST19和ST34因管家基因的改变产生不同的ST型，但血清型都为鼠伤寒沙门菌。

　　STI7的印第安纳沙门菌主要分离于鸡，再次证实该克隆的主要宿主为鸡.ST19和ST34的鼠伤寒沙门菌、ST11的肠炎沙门菌以及ST40的德尔卑沙门菌都主要分离于人和家禽(鸡和猪)，这种人和动物分离株的遗传克隆相似性表明它们具有共同的祖先，并揭示了沙门菌的主要来源于动物。

　　沙门菌普通对常用抗生素耐药，本研究检测结果显示其对氨节西林、萘啶酸、四环素和头孢派酮这些治疗人类常用药物的耐药率与其它研究[1-13]相比偏高，抗广谱头孢菌素和氟喹诺酮类药物的病原菌在我国出现和传播[-.10，Pearson相关性系数表明人源与动物源(包括鸡源和猪源)沙门菌在耐药性之间存在显著的相关性，并且鸡源沙门菌对头孢菌素类和氟喹诺酮类的耐药率高于人源沙门菌，表明这种耐药菌在这类家禽群中建立起来，但随着抗生素的大规模使用，沙门菌对这类药物的耐药在中国许多不同流行地区的患者中也能检测到，因此动物中抗生素的使用，使得沙门菌表现出抗药性，通过生产链传播给人类，导致人类的耐药。

　　沙门菌抗生素的耐药性在不同血清型上存在差异。氨苄西林的抗性主要表现在肠炎、印第安纳、鼠伤寒、德尔卑和汤卜逊沙门菌，这与氨苄西林是中国家畜中使用最早和最广泛的抗生素有关。耐药性的发展可以通过广泛使用抗生素来选择[0]，并且这些血清型具有MDR表型，肠炎沙门菌主导耐药谱型为：AMP-

　　NA-TE，AMP-CFP-NA和AMP-CFP-NA-

　　TE与申永秀等[1])的研究结果一致。分离于鸡的耐药模式和分离于人的相同，证实沙门菌在人和动物之间传播。德尔卑沙门菌对四环素也具有较高的耐药率，与四环素已在中国大陆的养猪业中广泛使用这一事实有关。耐药菌株通过猪肉或猪肉衍生产品传染给人类，引起人类对四环素高耐药[2-2])。对氟喹诺酮类和头孢菌素类耐药率较高的是印第安纳沙门菌，并对多种抗生素的耐药率高于其它血清型，相比其它血清型更易形成XDR，这种耐药现象与鼠伤寒沙门菌DT104和其变体相似，尽管一些研究表明出现这种泛耐药的现象可能与1类整合子和耐药基因组成的基因簇有关。但关于抗性机制的数据相对较少，这种血清型的耐药状况与国内报道一致[a.2-3)，但其它国家的耐药情况较我国轻7，反映这种血清型对抗生素的耐药性可能存在地域性差异。另外，这种血清型在鸡中的高携带率，显示出动物源沙门菌的耐药性较人源更为复杂，且一定程度反映了动物源沙门菌在耐药方面扮演着重要的角色。汤卜逊沙门菌对氟喹诺酮类和头孢菌素类药物也有较高的耐药率，因此这种血清型可能代表一个XDR克隆，泛耐药趋势也会在其它血清型中发展[]。虽然国家对抗生素的使用具有明确的规定，但在畜牧业中抗生素被广泛用于促进生长、预防和治疗。在农场上，特别是在广大农村地区的家庭农场，抗生素被广泛滥用和过度使用，意味着这些动物成为了耐药细菌的主要储存库，因此减少抗生素在动物中的滥用是控制沙门菌耐药的关键。

　　本研究表明沙门菌血清型和ST型有高度相关性，动物是沙门菌的主要储存库，人感染沙门菌可由动物传播引起。同源复合体有其独特的地区分布。沙门菌耐药水平较高，多重耐药性情况严重，人源与动物源

　　(鸡源和猪源)沙门菌在耐药性之间存在显著的相关性。沙门菌耐药表型与血清型相关，对氨苄西林抗性的肠炎、印第安纳、鼠伤寒、德尔卑和汤卜逊沙门菌具有MDR表型，对氟喹诺酮类和头孢菌素类耐药的印第安纳沙门菌是XDR克隆，而汤卜逊沙门菌有形成一种超级耐药的趋势。

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