不同褐化程度茶树组培的转录组分析

　　摘要：茶树为山茶属多年生常绿木本植物，内含茶叶多酚类物质具有广泛的应用。然而在茶树组织培养过程中，褐化是一个棘手的问题，阻碍茶树快繁体系的建立。为研究茶树外植体褐化过程中的分子机制，以轻、重两种不同褐化程度的茶树外植体为研究材料，运用RNA-Seq技术对样品进行转录组测序和功能分析，共筛选出872个差异表达基因(DifferentiallyExpressedGenes，DEGs)，其中507个显著上调，365个显著下调。通过GO和KEGG数据库，对DEGs进行功能注释分析，显示茶树组培褐化过程中与衰老、酶氧化和脂膜代谢等过程密切相关。进一步分析发现，在872个DEGs中，2个酶褐化相关基因、2个细胞色素P450转录因子和2个WRKY转录因子，其表达水平在两个样本间显著差异调控。因此，本研究发现了茶树叶片在组培过程中与酶促褐化相关的潜在基因，为解析茶树组织培养褐化过程的分子调控提供了理论依据。

　　关键字：茶树(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.);褐化;转录组测序;组培

　　茶树(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.)为山茶属多年生常绿木本植物，内含茶多酚、氨基酸、咖啡碱等多种对人体有益的物质，具有降脂减肥(袁野等,2016)、抗氧化(郭金龙,2010)、助消化和调理肠胃(屠幼英等,2002;吕晓华等,2017;李解等,2015)等功效，是世界三大无酒精饮料之一。近年来，随着国家乡村振兴和扶贫产业的快速发展，茶叶产业得到稳步提升，茶树新品种在茶叶加工、品质形成过程中的作用与日俱增，产业对于优良无性系茶苗的需求也更为迫切。茶树组培快繁体系具有周期短、繁殖系数高、易继承亲本的优良性状等优势，但茶树内含较高的多酚类物质，褐化现象严重，成为茶树快繁体系的瓶颈。

　　目前，研究者通过筛选植物生长调节剂(邱璐等,2000)，运用各类抗氧化剂和吸附剂(黄燕芬等,2009)，改善茶树组培过程中的培养方式和培养环境(邬秀宏等,2012)等技术手段能够降低和延缓褐化影响，但褐化损伤的分子机尚不清楚，问题也未得到实质性解决。随着Illumina测序技术的快速发展，国内外研究者开展了关于植物褐化分子调控机理的研究，Gao等(2020)在牡丹组织培养愈伤组织褐变的遗传调控研究中发现，包括MYB、bHLH和WRKY在内的6个转录因子以及包括PsCYP71A、PsI2ʹH、PsSTH-21、PsUGT和PsGST在内的其他基因可能参与调节牡丹愈伤组织褐变。

　　Zhou等(2020)通过对低温贮藏过程中褐变的“旺角”梨核进行转录组分析，筛选出5121个DEGs(DifferentiallyExpressedGenes)，并进行功能注释，鉴定出一些参与氧化还原反应、膜脂代谢和酶褐变的褐变相关DEGs。本研究利用Illumina测序技术对轻、重两种不同褐化程度的茶树叶片外植体进行研究重两种不同褐化程度的茶树叶片外植体进行研究，筛选影响茶树外植体褐化的相关基因进行表达分析和功能鉴定，以期发掘茶树叶片在组培过程中与褐化相关的潜在基因，为解析茶树组织培养褐化过程的分子调控提供了理论依据。

　　1结果与分析

　　1.1测序数据质控和参考基因比对结果

　　通过对不同程度褐化的茶树叶片进行转录组高通量测序获得Rawreads，经过Rawreads数据过滤，获得Cleanreads和数据统计结果。轻度褐化组(LightBrowning，LB)和重度褐化组(HeavyBrowning，HB)分别获得46864566、45008534条Cleanreads，样品Q20、Q30值均分别高于97%、93%，且与参考基因组对比率达到89%以上，其中与基因组外显子区域的reads数对比率高于60%，表明此次转录组测序错误率低、整体测序质量高、与参考基因组比对覆盖率高，可以进行下一步分析。

　　1.2差异基因分析

　　以|log2(FoldChange)|>0&padj<0.05为差异基因筛选标准，通过对不同程度褐化样品的DEGs进行筛选，统计筛选所得的DEGs数量，检测所得差异表达基因为872个，其中上调表达的有507个，下调表达的有365个。表明茶树组培叶片在褐化程度不断加深的过程中，组培叶片的部分调控机制伴随发生改变。

　　1.3差异基因的GO功能富集分析

　　对DEGs进行GO功能注释，872个差异基因中被富集在620个GO功能类别，选取主要富集的30个GO功能条目，其中，属于生物过程的主要有光合作用(Photosynthesis)、氧化应激反应(Responsetooxidativestress)、小分子分解代谢过程(Smallmoleculecatabolicprocess)、细胞碳水化合物代谢过程(Cellularcarbohydratemetabolicprocess)以及多元醇等多个分解代谢过程(Catabolicprocess)。

　　属于细胞组成的主要有光系统(Photosystem)、光合膜(Photosyntheticmembrane)、类囊体(Thylakoid)、光系统I(PhotosystemI)、光系统II(PhotosystemII)，且差异基因均为下调表达;属于分子功能的主要有辅因子结合(Cofactorbinding)、血红素结合(Hemebinding)、辅酶结合(Coenzymebinding)、氧化还原酶活性(Oxidoreductaseactivity,)、抗氧化活性(Antioxidantactivity)、水解酶活性(Hydrolaseactivity)。

　　1.4差异基因的KEGG富集分析

　　通过对872个DEGs进行KEGGPathway富集分析，发现共有116个差异基因被注释到74个通路中，DEGs注释率为13.3%。其中主要富集下调表达的有光合作用(Photosynthesis)10个基因、光合作用-触角蛋白(Photosynthesis-antennaproteins)6个基因，上调表达的有类黄酮生物合成(Flavonoidbiosynthesis)8个基因、苯丙素生物合成(Phenylpropanoidbiosynthesis)11个基因、二萜类生物合成(Diterpenoidbiosynthesis)3个基因、酪氨酸代谢(Tyrosinemetabolism)3个基因、苯丙氨酸代谢(Phenylalaninemetabolism)2个基因。

　　2讨论

　　基因表达具有时间特异性，茶树叶片组织培养过程中，不同程度褐化条件下，存在表达水平显著差异的基因或转录本。本研究基于高通量测序技术，对褐化程度轻、重的茶树组培叶片进行转录组测序，通过生物信息学分析，筛选所得差异表达基因为872个，其中上调表达的有507个，下调表达的有365个，这些基因大多数参与生物过程，如代谢、细胞过程和生物过程，其中多数具有催化活性和结合功能。

　　KEGG通路分析表明，注释基因主要参与光合作用、类黄酮生物合成、苯丙素生物合成、二萜类生物合成、酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢。以上结果表明，在组培叶片褐化过程中存在氧化还原状态、脂膜稳定性和底物组成的一些变化，这些结果与以往的研究结果一致，即植物褐化与许多过程相关，包括衰老、酶氧化和脂膜代谢等过程(Dongetal.,2015;Francketal.,2006;Linetal.,2016)。苯丙烷代谢途径中的酚类合成受几种关键酶的调控，包括PAL(Phenylalanineammonia-lyase)、CHS(Chalconesynthase)和CHI(Chalconeisomerase)，是植物体内多酚和黄酮类化合物形成的重要开关，当新鲜切割的植物组织暴露于外界空气中时，会导致组织褐变(Alegriaetal.,2016;Suehiroetal.,2014)。

　　茶树中苯酚和醛的合成也始于苯丙烷途径衍生的苯丙烷，由苯丙氨酸转化为查尔酮和一系列酶催化共同完成，本研究在872个差异基因中，对组培叶片褐化可能相关的几种关键酶PPO(Polyphenoloxidase)、PAL(Phenylalanineammonia-lyase)(李南羿等,2009)和Tyrosinase(Wichersetal.,2003)相关基因进行了分析，结果显示PPO等基因表达量在褐化程度轻、重的2个样品中未呈现与前人研究结果相似的趋势。

　　但实验中我们检测到苯丙氨酸代谢中AMP-binding(TEA034012)、酪氨酸代谢中ADH_N(TEA007219)2个酶相关基因表达活性与褐化程度具有明显的关联性，二者在茶树组培褐化过程中基因的上调高表达与褐化程度呈正相关规律。细胞色素P450在植物体内黄酮生物合成中起着重要作用。有研究表明，细胞色素P450相关基因表达量与植物组织褐变呈正相关规律，研究者分别在荷花与蝴蝶兰实验中发现，细胞色素P450的高表达会导致荷花组织和蝴蝶兰外植体的褐化(Wangetal.,2013;Xuetal.,2015)。

　　本研究中，发现2个细胞色素P450转录因子基因(TEA033874、TEA030439)与茶树组培叶片褐化相关，且均表现为基因高表达与组织褐化程度加深的规律，这与前人的研究结果保持一致。WRKY转录因子是增加活性氧途径中相关植物基因在生物、非生物和氧化应激反应中表达的重要诱导因子(Eulgemetal.,2007;Eulgemetal.,2000)。Zhang等(2019)在绿色核桃壳褐变研究中发现，一个含有保守WRKY结构域以及C2H2型锌指的WRKY转录因子基因在褐变绿色核桃壳中显著表达，证实了WRKY转录因子与植物组织褐变的相关性。

　　与前人的研究相互印证，本研究中我们发现2个WRKY转录因子基因(TEA027312、TEA023720)上调高表达与组织叶片褐化程度表现为正相关规律，首次揭示了WRKY转录因子与茶树组培褐化程度的相关性。而针对候选基因与茶树组培的褐化程度有因果关系，还需后续对基因的结构和功能表征研究来进一步证实。本研究比较了不同褐化程度茶树组培之间的转录组，共筛选出872个差异表达基因，其中显著上调507个，显著下调365个。通过GO和KEGG数据库，对差异基因进行功能注释分析，显示茶树组培褐化过程中与衰老、酶氧化和脂膜代谢等过程相关。进一步分析发现，在872个差异基因中，2个酶褐化相关基因、2个细胞色素P450转录因子和2个WRKY转录因子，其表达水平在两个样本间显著差异调控。本研究为解析茶树组织培养褐化过程的分子调控提供了理论依据。

　　茶叶种植论文范例：唐代长江流域的茶叶种植与饮茶习俗

　　3材料与方法

　　3.1试验材料

　　选取重庆市农业科学院茶叶研究所茶树资源圃(105º89’20’’E，29º38’04’’N)栽种的福鼎大白茶为供试材料，以当年生健康无病虫害的同株茶树叶片作为外植体，经MS培养基培养，获得茶树叶片组培褐化材料。以褐化面积小于叶片面积1/3的样本作为轻度褐化组选择不同程度褐化茶树叶片作为轻度褐化组(LightBrowning，LB)，以褐化面积大于叶片面积2/3的样本作为重度褐化组(HeavyBrowningBrowning，HB)，液氮速冻，保存于-80℃冰箱中，用于后续做转录组测序分析，为了排除误差干扰，样品设置3个生物学重复，每个重复包含4-5个组培叶片。

　　参考文献：

　　AlegriaC.,GoncalvesE.M.,Moldao-MartinsM.,Cisneros-ZevallosL.,andAbreuM.,2016,Peelremovalimprovesqualitywithoutantioxidantloss,throughwound-inducedphenolicbiosynthesisinshreddedcarrot,PostharvestBiology&Technology,120:232-239

　　DongY.,LiuL.Q.,ZhaoZ.,ZhiH.H.,andGuanJ.F.,2015,Effectsof1-mcponreactiveoxygenspecies,polyphenoloxidaseactivity,andcellularultra-structureofcoretissuein'yali'pear(pyrusbretschneiderirehd.)duringstorage,HorticultureEnvironment&Biotechnology,56(2),:207-215

　　EulgemT.,andSomssichI.E.,2007,NetworksofWRKYtranscriptionfactorsindefensesignaling,Curr.opin.plantBiol,10(4):366-371

　　EulgemT.,RushtonP.J.,RobatzekS.,andSomssichI.E.,2000,TheWRKYsuperfamilyofplanttranscriptionfactors,TrendsinPlantence,5(5):199-206

　　作者：李解1,2翟秀明1,2杨娟1,2唐敏1,2*侯渝嘉1,2*