植物保护学报杂志投稿格式参考范文：普通大蓟马复眼结构、趋光行为 及视蛋白基因表达规律

　　引言

　　华南地区位于我国南部，由山地、丘陵和平原构成，土壤富含植物生长所需的各种有机质;该地区属于热带和亚热带季风气候，全年高温多雨，冬季温暖，夏季漫长;适宜的温度和充足的水分为豆科植物创造了良好的生长条件，间接导致喜食豆科植物的缨翅目害虫为害日益严重，其中普通大蓟马 Megalurothrips usitatus 在海南省豇豆 Vigna unguiculata 上的为害尤为严重。目前，化学防治仍是防控的主要手段，在长期化学药剂的高压选择下，海南省普通大蓟马已对多种新型药剂产生不同程度抗性，因此，研发绿色环保的防控技术迫在眉睫。

　　复眼作为昆虫最主要的视觉器官，在昆虫觅食、求偶、产卵、越冬、迁徙和躲避天敌等视觉行为中起着重要作用。昆虫复眼分为重叠像眼和并列像眼，夜出型昆虫一般属于重叠像眼，日出型昆虫一般属于并列像眼。复眼由许多小眼组成，小眼数量是影响昆虫视觉能力的主要因素。目前仅对一些重大发生的害虫和天敌昆虫复眼形态结构特征进行了初步研究，而关于普通大蓟马复眼结构的研究较少。光感受器是视觉系统中的关键组成部分，根据昆虫光感受器的光谱吸收最大值，光感受器可分为紫外敏感视蛋白、蓝光敏感视蛋白和长波敏感视蛋白。最新研究发现，普通大蓟马中存在 4 种视蛋白。因此，了解普通大蓟马复眼形态结构，探究其视蛋白基因功能以及视蛋白对趋光行为潜在的调控机制对于防控该害虫具有重要意义。

　　昆虫对光具有趋避性，多数昆虫对光表现为趋性，尤其是对紫外光、蓝光和绿光。关于蓟马光谱敏感性的研究也很多，但已有研究未涉及普通大蓟马最敏感的紫外光区，而普通大蓟马是否对紫外光表现出特定的偏好性以及紫外光是否会影响普通大蓟马对特定波长光的偏好性均尚不清楚。

　　为明确普通大蓟马的光谱敏感性及其视蛋白基因的潜在行为调控机制，通过扫描电镜观察普通大蓟马雌、雄成虫复眼的外部形态特征，采用自制行为测定装置测定普通大蓟马在昼夜节律、单一光源和多种光源下的趋光性，采用实时荧光定量 PCR 技术分析 4 个视蛋白基因在普通大蓟马成虫不同组织及 UV-A 不同处理时间后的表达量变化，以期为防控普通大蓟马提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　供试虫源：2024 年 5—6 月自海南省五指山市毛阳镇豇豆地采集普通大蓟马成虫(雌雄比例约为 3∶1 或更高)带回实验室，于温度(26±1)℃、相对湿度(70±5)%、光周期 14 L∶10 D 的实验室内饲养，用洗净的新鲜豇豆饲喂，繁殖 1 代后取健康活跃的雌、雄成虫供试。新鲜豇豆品种为南豇 1 号，购于海南省三亚市南滨农贸市场。

　　试剂和仪器：TRIzol 试剂，美国赛默飞世尔科技公司;PrimeScript™Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，日本 TaKaRa 公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司;其余试剂均为国产分析纯。SZ61 体视显微镜，日本 Olympus 公司;K850 临界点干燥仪，英国 Quorum 公司;D II-29030 喷金仪，日本 JEOL 公司;HITACHI SU8100 型扫描电镜，日本 HITACHI 公司;AriaMx 实时荧光 PCR 仪，美国 Agilent 公司;Micro Drop 紫外分光光度计，美国 BIO-DL Corporation 公司;功率均为 3 W 的 UV-A(波长 365 nm)、蓝光(波长 460 nm)、绿光(波长 520 nm)和白光(色温 6500 K)的 LED 单色光源，中山市古镇镇优威固照明电器厂;暗箱为正方体结构，边长 30 cm，板宽 10 mm，底部镂空，由黑色聚苯乙烯泡沫板组成，能防止其他光源干扰;亚克力材料，惠州市瑞峰亚克力制品有限公司。

　　行为测定装置：自制。由透明与不透明亚克力板制成，亚克力板厚度均为 6 mm。装置自上至下由趋光室、反应室、接虫器、光源和底板 5 个部分组成。趋光室为五棱柱结构，反应室为长方体，接虫器为圆柱体，底板为透明亚克力板。反应室与趋光室在镂空处对齐连接，4 个面共形成 4 个趋光室，接虫器位于反应室内部中央，底板位于行为反应装置最下部，光源置于每个趋光室后方，光线正好能透射到趋光室。

　　1.2 方法

　　1.2.1 普通大蓟马复眼结构的扫描电镜观察

　　取健康活跃的普通大蓟马雌、雄成虫各 8~10 头放到 2.5% 戊二醛溶液中预冷，4℃避光固定 24 h;用 pH 为 7.2 的 0.1 mol/L PBS 缓冲液漂洗固定样品 3 次，每次 15 min;将样品依次置于不同浓度乙醇溶液中脱水;再置于 100% 叔丁醇溶液置换 30 min;将样品置于干燥仪中干燥，用导电胶带将干燥样品粘在载物台上，挤压吸液球吹去未粘牢固的样品，将样品放入喷金仪中喷金使样品表面形成导电膜，即获得扫描电镜样品。将制备好的普通大蓟马雌、雄成虫样品置于扫描电镜下观察其复眼结构，雌、雄成虫各观察 2~3 头。

　　1.2.2 普通大蓟马对不同单色光源的趋性测定

　　分别于白天 08:00—17:00 和夜间 21:00—05:00 在室内黑暗条件下测定普通大蓟马成虫对 UV-A、蓝光、绿光和白光 4 种单色 LED 光源的选择行为。关闭室内无关干扰光源，在自制装置外部装暗箱。用吸虫器将普通大蓟马成虫接入到行为测定装置的接虫器内，将接虫器置于底板中央，将组合好的装置主体置于底板上，确保接虫器位于反应室中心。安装单色光源，每次安装 1 种单色光源，将单色光源置于趋光室侧面后方。外部安装暗箱，开启光源。每种单色光源分别连续处理 3、5、10、20、40 和 60 min，记录每种单色光源每个时间段试虫进入趋光室的数量。每种单色光源设 5 组生物学重复，每组 30 只试虫，每组试虫试验结束后，用酒精擦拭装置，计算趋光率，趋光率 = 反应虫数 / 接入虫数 ×100%。

　　1.2.3 普通大蓟马对多种不同光源的趋性测定

　　在 08:00—17:00 于室内黑暗环境下测定普通大蓟马成虫对多种不同光源的趋性。当测定对 2 种单色光源的趋性时，将每次安装 1 种光源设置为安装 2 种单色光源，分别为 UV-A 和蓝光、UV-A 和绿光及 UV-A 和白光，测定时 2 种单色光源夹角为 180°，每组处理 20 min，其他方法同 1.2.2;当测定对 3 种单色光源的趋性时，每次安装 3 种单色光源，分别为 UV-A、蓝光和白光及 UV-A、绿光和蓝光，测定时 3 种单色光源摆放顺序随意，但位置呈 T 型，其他方法同 1.2.2;当测定对 4 种单色光源的趋性时，每次安装 4 种单色光源，分别为 UV-A、绿光、蓝光和白光，测定时 4 种单色光源摆放顺序随意，但位置呈十字型，其他方法同 1.2.2。

　　1.2.4 普通大蓟马各组织中视蛋白基因表达的测定

　　选取健康活跃的普通大蓟马成虫约 2000 头，每次取 100 头试虫置于载玻片上方，利用低温冻晕试虫。在体视显微镜下用昆虫针将试虫虫体解剖为头、胸和腹 3 个部分。最终每个部位样品约 660 头试虫左右，每个样品设 3 个生物学重复。将所得样品分批次置于液氮中速冻，随后转移至 - 80℃冰箱保存。采用 Trizol 法提取不同组织样品的总 RNA，按照 PrimeScript™Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书合成 cDNA，置于 - 20℃冰箱保存。

　　参考相关研究设计视蛋白基因 Rh-1、Rh-2、Rh-3 和 UVRh-1 的引物，以 β actin 为内参基因，所有引物均委托公司合成。按照 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒说明书进行 RT-qPCR 扩增。20 μL RT-qPCR 反应体系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、正反向引物各 0.4 μL、cDNA 模版 2 μL、ddH₂O 7.2 μL。反应程序：95℃预变性 30 s;95℃变性 10 s，60℃退火 30 s，40 个循环;熔解曲线：95℃变性 15 s，60℃退火 60 s，95℃变性 15 s。每个样品设置 3 个重复。根据 2-ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达量。

　　1.2.5 UV-A 对普通大蓟马视蛋白基因表达的影响

　　选取健康活跃的普通大蓟马成虫 50 头，置于石英玻璃管内，管内提前放豇豆供试虫取食，随即置于室内暗箱黑暗处理 12 h，除对照外，将试虫转移至另一个相同暗箱中，暗箱内安置 UV-A 单色光源，对试虫分别胁迫处理 3、5、10、20、40 和 60 min，每个处理 50 头试虫，重复 3 次，将处理后试虫置于液氮中速冻，随后转移至 - 80℃冰箱中保存。按照 1.2.4 方法提取各处理样品的总 RNA，合成 cDNA 及测定 4 个视蛋白基因的相对表达量。

　　1.3 数据分析

　　利用 SPSS 20.0 软件对试验数据进行统计分析，两者之间采用 t 检验法进行差异显著性检验，三者及以上采用 Tukey 法进行差异显著性检验。

　　2 结果与分析

　　2.1 普通大蓟马复眼外部形态特征

　　普通大蓟马雌、雄成虫的复眼位于虫体触角两侧、头部两端;复眼呈不规则肾形，在虫体正面、两侧面、腹面和背面均有分布;雌、雄成虫复眼单侧约有 70 个小眼，小眼向外凸出，近似呈圆形，直径大小不一，排列疏松且表面光滑，各小眼之间着生数量不一的感觉毛;在成虫复眼边缘有由多个小眼组成的背部边缘区域;3 个背单眼位于虫体背面且外缘有单眼鬃着生，其中 2 个对称背单眼靠近虫体胸部，另一个背单眼远离胸部靠近触角。

　　2.2 普通大蓟马对单色光源的趋性

　　2.2.1 昼夜条件下对不同单色光源的趋性

　　随着处理时间的增加，普通大蓟马成虫对同种光源的趋光率总体呈上升趋势。在白天 08:00—17:00，普通大蓟马成虫对 UV-A 的趋光率始终最高，除处理 40 min 时与对白光的趋光率无显著差异外，其他均与对白光、蓝光和绿光的趋光率差异显著。在夜间 21:00—05:00，除处理 5 min 时普通大蓟马成虫对 UV-A 的趋光率与对白光的趋光率和对蓝光的趋光率差异显著外，其他处理之间均差异不显著。

　　2.2.2 昼夜节律下对同一单色光源的趋性

　　白天白光处理不同时间后普通大蓟马的趋光率均显著高于黑夜白光处理后普通大蓟马的趋光率。白天 UV-A 处理不同时间后普通大蓟马的趋光率均显著高于黑夜 UV-A 处理后普通大蓟马的趋光率。尽管白天蓝光处理 3 min 和 5 min 后普通大蓟马的趋光率与黑夜蓝光处理后普通大蓟马的趋光率差异显著，但其他处理的趋光率之间均差异不显著。白天绿光处理不同时间后普通大蓟马的趋光率与黑夜绿光处理后普通大蓟马的趋光率之间差异不显著。

　　2.3 普通大蓟马对多种不同光源的趋性

　　处理 20 min 后，普通大蓟马对 UV-A 的趋光率极显著高于对白光、蓝光和绿光的趋光率。在不同组合的单色光源中，普通大蓟马对 UV-A 的趋光率均显著高于对其他光源的趋光率。

　　2.4 普通大蓟马视蛋白基因的表达规律

　　2.4.1 在各组织中视蛋白基因的表达

　　普通大蓟马视蛋白基因 Rh-1、Rh-2、Rh-3 和 UVRh-1 的相对表达量在不同组织部位中存在显著差异，其中在头部中的相对表达量均远远高于在胸部和腹部的相对表达量，且视蛋白基因在胸和腹中表现出低表达的现象。在头部中，视蛋白基因 Rh-1 的相对表达量最高，其次为视蛋白基因 Rh-2 和 Rh-3，视蛋白基因 UVRh-1 的相对表达量最低。

　　2.4.2 UV-A 胁迫处理下视蛋白基因的表达

　　UV-A 胁迫处理不同时间后，普通大蓟马视蛋白基因 Rh-1 的相对表达量呈上升趋势，部分处理时间较对照显著上调;Rh-2 的相对表达量在部分处理时间较对照显著上调;Rh-3 的相对表达量除个别处理时间显著低于对照外，其他处理与对照无显著差异;UVRh-1 相对表达量在部分处理时间较对照显著降低或增加，其他处理与对照之间无显著差异。

　　3 讨论

　　复眼是昆虫感受外界光线的主要器官，其结构特点反映了昆虫为适应环境而演化的生存习性和行为方式。本研究结果表明，普通大蓟马复眼呈不规则肾形，位于头部两侧，占据了头部大部分空间，从而提高了其视野范围;雌、雄成虫复眼单侧大约各有 70 个小眼，且复眼外部形态特征上无明显差异。与其他蓟马研究结果的差异可能与昆虫种类、个体大小和拍摄角度不同有关。

　　昆虫为了适应环境中的光线、温度、湿度、食物供应、相互竞争和捕食等逐渐形成了一种复杂的昼夜节律行为模式，这种节律行为有助于它们更好地生存和繁殖。本试验研究发现，普通大蓟马对昼夜有感知，其趋光行为在白天和夜间存在差异，推测普通大蓟马复眼类型为并列像眼。

　　趋光昆虫主要对不同波长的光发生趋光反应。本研究结果显示，在不同光源组合中，普通大蓟马对 UV-A 的趋光率最明显，与其他蓟马对紫外光区表现出强烈吸引力的研究结果基本一致。

　　视蛋白是一类关键的光感受蛋白，主要在复眼等光感受器组织中高表达。本研究结果显示，普通大蓟马视蛋白基因在头部高表达，存在组织特异性，UV-A 照射能诱导视蛋白基因表达，但关于视蛋白基因的生理功能及其与相关蛋白的协同作用还需进一步验证。

　　本研究明确了昼夜节律、光源和视蛋白表达规律等因素对普通大蓟马的影响及相互关系;但本研究仅在室内比较了 4 种单色光源，下一步将增加光源数量，并在田间开展试验。

宁恒亨;王朝政;蒿文勇;金海峰;李 芬;吴少英,海南大学三亚南繁研究院;海南大学热带农林学院;海口海关技术中心;阳谷县农业农村局,202406