中山大学学报·医学科学版杂志投稿格式参考范文：高原低氧环境抑制小鼠脾脏组织碳代谢的分子机制

　　引言

　　高海拔地区具有低压、低氧、高辐射等特点，使机体氧分压降低，血氧饱和度降低，组织细胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生增多 [1]，细胞还原状态增加，线粒体膜电位降低，导致氧化应激和线粒体功能障碍 [2]。已有研究发现，低压低氧环境下缺氧诱导因子(hypoxia inducible factors，HIFs)表达水平显著升高，HIFs 作为代谢适应氧气变化的主要调节因子 [3]，HIFs 通过基因表达调控，改变线粒体形态和功能，调控细胞适应蛋白质合成、能量代谢、线粒体呼吸、脂质和碳代谢以及营养获取，介导细胞对缺氧的适应性代谢反应 [4-5]。研究发现，脾脏具有清除衰老红细胞、参与免疫应答和血液过滤等功能 [6-7]，能够调节血液中脂肪、糖分和氨基酸等物质的代谢，帮助维持人体的能量平衡。

　　脾脏是一个消耗大量氧气的器官，对缺氧非常敏感 [8-9]，但目前对脾脏组织代谢反应研究较少，高原低氧环境对代谢作用机制尚不明确。随着分子生物学技术的不断发展，多组学分析技术能够全面、深入地了解生物体内的生物分子组成和相互作用，提供更精细的测量数据，从而鉴定各种有效的蛋白质、生物标志物等，促进对生物系统的深入了解 [10-11]。因此，本研究以小鼠脾脏为研究对象，基于转录组测序、蛋白质组学和非靶向代谢组学，阐明高原低氧环境下碳代谢通路变化的分子机制，为代谢相关疾病研究提供参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　本实验所选 SPF 级实验动物购买于西安交通大学医学部实验动物中心，6 - 8 周龄 C57BL/6 雄性健康小鼠，动物许可证号：SYXK2020 - 005。将小鼠随机分为两组(每组 5 只)分别饲养于不同海拔，以西安交通大学医学部实验动物中心(海拔 400m)作为本次实验的对照组即平原常氧组模型(plain spleen control，PSC 组);以青海省果洛藏族自治州玛多县人民医院实验动物房(海拔 4200m)作为实验组即高原低氧组模型(high - altitude spleen test，HST 组)。在饲养过程中，两组均维持相同的温度，湿度，饮水，饮食。饲养 30d 后无菌采集小鼠脾脏组织并保存于液氮中。该项目已通过青海大学伦理协会审查(批准号：2020 - 15)。

　　1.2 实验试剂与仪器

　　无酶无菌水购自北京 Solarbio 公司;引物购自上海 SangonBioteCh 公司;TrizolRNA 提取试剂购自美国 Invitrogen 公司，于日本 Takara 公司购得逆转录试剂盒 [PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser，(RR047A)] 和 qPCR 检测试剂盒 TB Green® Premix Ex Taq ™ Ⅱ(Tli RNaseH Plus)，(RR820A);硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜购自美国 Pall Corporation 公司。兔源异柠檬酸脱氢酶 3 [isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) alpha，IDH3A] 蛋白抗体、兔源琥珀酸辅酶 A 连接酶(succinateCoenzyme A ligase，SUCLA2)蛋白抗体、兔源苹果酸脱氢酶 2(malate dehydrogenase 2 ，MDH2)蛋白抗体、兔源磷酸甘油酸变位酶 2(phosphoglycerate mutase 2，PGAM2)蛋白抗体、鼠源烯醇化酶(enolase 3，ENO3)蛋白抗体、兔源磷酸核糖焦磷酸合成酶 2(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2，PRPS2)蛋白抗体和兔源核酮糖 - 5 - 磷酸 - 3 - 差向异构酶(ribulose - 5 - phosphate - 3 - epimerase，RPE)蛋白抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均购自 Proteintech 公司;兔源 6 - 磷酸葡萄糖酸酯酶(6phosphogluconolactonase，PGLS)蛋白抗体购自 Affinity 公司;增强化学发光液(ECL)购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司;荧光定量 PCR 仪(Roche 公司，瑞士);电泳仪、转膜仪(Bio - Rad 公司，美国);凝胶成像系统(VILBER 公司，法国)。

　　1.3 小鼠脾脏指数测定和组织病理学检查

　　称量小鼠空腹体质量后，记录无菌取出的小鼠脾脏组织质量。通过以下算式计算小鼠脾脏指数：脾脏指数 = 脾脏质量 (g)/ 体质量 (g)×100%。将小鼠脾脏组织置于 40g/L 多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水处理，随后将组织石蜡包埋切片 5 - 6µm，二甲苯脱蜡后，使用苏木精和伊红(H&E)染色，显微镜下观察组织切片。

　　1.4 高通量转录组测序

　　总 RNA 的提取：使用 TRIzol 法提取小鼠脾脏组织的总 RNA，检测其浓度及纯度，并立即储存于 - 80℃冰箱。使用分光光度计进行测量 RNA 浓度及 260/280、260/230 吸光度比值。随后，采用 Agilent 2100 bioanalyzer 分析仪精确测定 RNA 完整性，对 RNA 样品进行严格质控。

　　cDNA 文库的构建：去除 RNA 样本中的核糖体 RNA 获得 mRNA，随机将各组 mRNA 剪成片段，转录为 cDNA。在平末端和磷酸化的 cDNA 中添加一个 3' 腺苷片段和修复末端的 Illumina 接头。采用 Illumina 高通量测序技术，对 mRNA 进行分离、纯化和测序，研究脾脏组织转录出来的所有 mRNA。

　　生物信息学分析：利用 FeatureCounts 分析软件统计基因原始表达量，通过过滤原始数据(raw reads)、检查测序错误率和 GC 含量分布，获得后续分析使用的 clean reads，并计算各个样本的基因表达值，对其表达量进行标准化，组间的差异表达基因可使用包分析，并校正 P 值。其中 llog2foldchangel20 且P−adjust<0.05的基因被定义为差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。随后对所获得的 DEGs 进行可视化并利用聚类方法进行分类。

　　GO(Gene Ontology，http://www.geneontology.org/)是描述基因功能的综合性数据库，采用 clusterProfile (3.4.4) 软件对 DEGs 进行 GO 功能富集分析，更好地理解 DEGs 的功能，并深入了解其与疾病之间的关系。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)利用高通量数据，分析细胞、有机体和生态系统的高层次功能与作用，应用 clusterProfiler (3.4.4) 软件对 KEGG Pathway 进行富集分析，其中P<0.05被认为是显著的。GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)即基因集富集分析是根据两组样本中基因表达量数据，寻找差异表达基因，根据 Fold change 值排序，展示两组样本的变化趋势，可以明显看出两组样本中通路的变化情况以及通路中相关基因的表达情况。

　　1.5 定量蛋白组学技术

　　将脾脏组织样品低温研磨成粉，加入适量 PASP 蛋白裂解液，振荡混匀后在冰水浴中超声 5min 使其裂解，提取蛋白，用 Bradford 蛋白定量试剂盒对样品蛋白质进行浓度测定，对其进行定量检测。蛋白样品中加入胰酶和 100mmol/L TEAB 缓冲液，混匀于酶切后加入胰酶和CaCl2酶切过夜。加入 TEAB 缓冲液复溶后加入乙腈溶解的 TMT 标记试剂，最后添加终浓度为 80mL/L 的氨水终止反应并进行除盐处理。

　　采用 EASY - nLCTM 1200TM - UHPLC 系统液相色谱仪和 QExactiveTM HF - X 质谱仪联用技术，进行液相色谱 - 串联质谱联用分析(北京诺禾致源有限公司)。使用 Proteome Discoverer 软件对原始结果做进一步过滤，做 FDR 验证以去除 FDR 大于 1% 的肽段和蛋白，提高分析结果质量，降低假阳性率。根据常见功能数据库注释结果对蛋白质进行识别，对所识别的蛋白质进行 GO 数据库，KEGG 数据库等功能数据库注释，对差异蛋白相对含量进行聚类热图分析和互作网络分析等，以了解不同蛋白的功能特性。

　　1.6 非靶向代谢组学

　　于 - 80℃冰箱取出组织样品，将 PBS 洗涤后的组织样品 4℃、15 000×g 离心 20min 后收集上清液于 EP 管中冻存，在样品中添加 1mL 预先冷却的萃取物，在液氮速冻、超声处理以及低温孵育离心后得到代谢产物，转移至 LC - MS 样品瓶中进行测定。使用液质联用(LC - MS/MS)技术检测脾脏组织中的代谢物，使用 Compound Discoverer 3.1 软件分析原始数据，定性定量检测代谢物。对正、负离子模式下的代谢物进行主成分分析(PCA)，揭示样品的概述分类，并对数据进行质量控制以保证结果的准确性和可靠度;随后对鉴定到的代谢物进行功能和分类注释，揭示不同代谢物差异。

　　1.7 实时荧光定量 PCR 和蛋白免疫印迹

　　实时荧光定量 PCR(RT - qPCR)步骤：将 RNA 逆转录为。以 β - Actin 作为内参，采用 2ΔΔCt法计算基因的相对表达量，反应体系包括 TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ 10µL，ddH2O 6.4µL，cDNA 2µL，前后引物各 0.8µL。经过 45 个循环扩增，检测 IDH3A、SUCLA2、MDH2、PGAM2、ENO3、PRPS2、PGLS、RPE 的 mRNA 表达量。

　　蛋白免疫印迹(Western blot)步骤：提取小鼠脾脏组织蛋白，并使用 BCA 法对所提取蛋白进行浓度测定，调整每孔上样量为 30µg。加样后进行 SDS - PAGE 电泳(恒压 90V)和转膜(恒流 200mA)。使用 TBST 洗液将 NC 膜清洗一次后，在室温下用无蛋白快速封闭液封闭 NC 膜 10min。加入相应稀释倍数的一抗 IDH3A (1:500)、SUCLA2 (1:1 000)、MDH2 (1:500)、PGAM2 (1:500)、ENO3 (1:5 000)、PRPS2 (1:500)、PGLS (1:500)、RPE (1:500)、β - actin (1:10 000)，在 4℃孵育过夜。第二天使用 TBST 洗液洗膜(5min / 次，6 次 + 10min / 次，1 次)后，分别加入相应的羊抗兔二抗(1:5 000)或羊抗鼠二抗(1:5 000)，于室温下孵育 1h。再次洗膜(6min / 次，5 次)后，用 ECL 化学发光液进行显色，使用法国 VILBER Fusion solo 成像分析系统成像分析。

　　1.8 统计学方法

　　数据分析使用 SPSS 18.0 软件和 GraphPad Prism8.4.0 软件，符合正态分布的计量资料采用xˉ±s表示，两组间比较采用两独立样本 t 检验，非正态性分布数据采用秩和检验。

　　P<0.05为差异有统计学意义。所有实验都是独立重复 3 次。

　　2 结果

　　2.1 小鼠脾脏指数检测

　　低氧暴露 30d 后，测量小鼠体质量，无菌采集小鼠脾脏组织并测量其质量，计算小鼠脾脏指数。发现小鼠脾脏质量较平原常氧显著减少 I$ (P<0.0001)$)。HST 组较 PSC 组小鼠体质量显著下降 ((P<0.0001))，脾脏指数降低 ((P<0.001))。结果表明，高原低氧环境刺激下小鼠脾脏组织重量减少。

　　2.2 小鼠脾脏组织病理学检测

　　在组织学分析 H&E 染色结果显示，HST 组小鼠脾脏组织白髓减少，生发中心范围扩大，分界模糊，并伴有静脉充血;此外，可见部分细胞凋亡、核固缩、核碎裂等。提示，高原低氧环境下小鼠脾脏组织发生炎症性病理学改变。

　　2.3 转录组测序分析

　　饲养 30d 后，采集小鼠脾脏组织，通过双端测序法分别测序 PSC 组和 HST 组的 5 个生物学重复样本，构建文库，每个样本都含有成千上万个基因，对这些基因计算表达量值(FPKM)，应用 PCA 对整体数据降维，简化数据，评价生物学重复的好坏，点之间的距离即代表着样本之间的相似程度。PCA 结果显示组内样本聚集，组间样本相对分散，说明本次转录组测序数据质量较高，可用于后续分析。

　　小鼠脾脏组织转录组测序分析 PSC 组和 HST 组共检测出个基因，以且P−adjust<0.05作为 DEGs 的筛选阈值，共鉴定出 4213 个 DEGs，其中 1947 个基因表达上调，2266 个基因表达下调。为了分析 DEGs 在不同实验条件下的生物学功能、细胞组分和分子功能，对富集到的 4213 个 DEGs 做了 GO 注释分析，发现差异表达基因显著富集在 B 细胞活化、氧化应激、氧化磷酸化等生物过程，免疫球蛋白复合体、呼吸链、ATP 酶复合体等细胞组分，以及 GTP 酶复合体等分子功能。对 DEGs 进行 KEGG 分析，对 KEGG 通路进行分类汇总，结果显示，碳代谢、氧化磷酸化、脂肪酸代谢等通路显著富集。提示机体碳代谢、能量代谢等在高原低氧胁迫下发生了重要变化。

　　2.4 蛋白质组学数据处理与分析

　　以 FC≥1.2，P−value<0.05为筛选阈值，筛选上调表达蛋白，以FC≤0.83，P−value<0.05为筛选阈值，筛选下调表达蛋白。对 PSC 组和 HST 组差异表达蛋白(DEPs)分析，发现 166 个蛋白表达上调，39 个蛋白表达下调。

　　对 PSC 组和 HST 组每个样品中关键差异蛋白相对含量进行聚类分析，利用聚类热图观察不同蛋白在组间比较时的上调、下调情况。对各样本差异蛋白的表达水平进行层次聚类分析。结果显示，同一蛋白分子在 PSC 组和 HST 组表达不同。提示，高原低氧暴露下小鼠脾脏组织中蛋白分子发生重要改变。

　　为了解差异蛋白在低氧胁迫下的生物学功能，对富集到的差异蛋白进行 GO 注释分析和 KEGG 富集分析，GO 注释分析结果显示，蛋白质磷酸化、氧化还原过程、代谢过程等在 BP 中富集，在 CC 中膜成分、核糖体、线粒体等细胞组分活性较强，在 MF 中 GTP 合成、ATP 合成及蛋白激酶活性显著富集。KEGG 结果显示，DEPs 参与碳代谢、脂肪酸代谢等途径。提示高原低氧条件下碳代谢通路发生了重要改变。

　　2.5 非靶向代谢组学分析

　　采用 PCA 的方法，观察 PSC 组和 HST 组样本之间的总体分布趋势。PCA 结果显示正负离子模式下，组间样本均分散，组内样本均相对聚集，说明代谢组学测序结果可靠，可用于后续分析。

　　火山图可直观显示差异代谢物的变化情况，设定筛选阈值为 VIP > 1.0，FC >1.5 或 FC <0.667 且 P - value<0.05，绘制火山图分析发现在正负离子模式下共有 95 种代谢物上调，38 种代谢物下调。

　　通过 KEGG 富集确定差异代谢物参与的主要生化代谢途径和信号转导途径。对差异代谢物进行 KEGG 富集分析发现，差异代谢物参与能量代谢、碳水化合物代谢等碳代谢相关途径。同样提示高原低氧条件下碳代谢通路发生了重要改变。

　　2.6 碳代谢通路的 GSEA 与 KEGG 富集分析

　　由于转录组测序、蛋白质组学以及非靶向代谢组学中 GO 和 KEGG 富集分析结果均与碳代谢相关，因此，本研究重点关注了碳代谢通路。为了分析碳代谢通路在高原低氧条件下的变化，对其进行 GSEA 富集分析，发现基因集富集分数(enrichment score，ES)小于 0，hits 图标记了通路基因集中的基因在 PSC 组富集，且 rank 在列表的尾端也表示基因在 PSC 组样本中表达量高，说明碳代谢通路在高原低氧胁迫下被抑制。对碳代谢通路具体分析，碳代谢通路 KEGG 富集图，本研究重点关注了糖酵解途径(embden - meyerhof - parnas，EMP)，磷酸戊糖途径(pentose phosphate ，PPP)，三羧酸循环(tricarboxylic acid，TCA)3 条途径。

　　2.7 碳代谢通路验证

　　采用 RT - qPCR 和 Western blot 技术检测碳代谢通路中关键基因和蛋白。结果显示，EMP 中 PGAM2、ENO3 的 mRNA 表达量和蛋白表达量呈现下调趋势，PPP 中 PRPS2、PGLS、RPE 的 mRNA 表达量和蛋白表达水平呈现下调趋势，TCA 中 IDH3A、SUCLA2、MDH2 的 mRNA 表达量和蛋白表达水平均显著下调，以上结果表明低氧暴露抑制了小鼠脾脏组织中碳代谢通路中的 EMP、PPP 以及 TCA，其关键蛋白下调表达会导致 ATP 生成减少，能量代谢发生紊乱。

　　3 讨论

　　低氧胁迫会影响机体的免疫功能、导致炎症反应、氧化应激、脂代谢失衡等一系列变化，课题组已有多项研究表明，HIF - 1α 在缺氧条件下表达上调，ROS 产生增多 [12 - 13]，诱导线粒体损伤，细胞功能障碍，导致急进高原人群可能会罹患急性高山病、高原脑水肿、高原肺水肿等 [14 - 15]。本研究通过构建高原低氧小鼠模型发现，相较于 PSC 组，HST 组小鼠脾指数降低;脾脏组织病理学显示，HST 组小鼠脾脏组织白髓减少、生发中心扩大，边缘区模糊并伴有静脉充血，提示高原低氧暴露 30d 后小鼠脾脏组织发生了重要病理性改变。但目前对其变化机制的研究尚少，因此，本实验通过转录组测序、蛋白质组学、非靶向代谢组学进一步分析 DEGs、DEPs 和 DEMs，旨在深入了解高原低氧条件下小鼠脾脏组织变化的分子机制。

　　为了深入了解高原低氧条件下小鼠脾脏组织中发生改变的关键通路，通过转录组测序，发现高原低氧条件下小鼠脾脏组织中共发现了 4213 个 DEGs，其中 1947 个基因表达上调，2266 个基因表达下调;通过蛋白质组学测序分析发现高原低氧条件下共有 166 个蛋白表达上调，39 个蛋白表达下调;此外，非靶向代谢组学分析发现正、负离子模式下共有 95 个代谢物上调，38 个代谢物下调。进一步对这些 DEGs、DEPs 和 DEMs 进行 KEGG 富集分析，结果显示共同富集到碳代谢通路。

　　碳代谢是细胞和组织中普遍存在的代谢过程，包括 EMP、PPP 以及 TCA 等过程，是细胞生长和发育的主要能量来源，并为其他代谢活动提供前体物质 [16]。研究发现，为了应对全身性缺氧，中性粒细胞重组其蛋白质组并增强细胞外蛋白质清除，从清除的蛋白质中释放氨基酸，从而维持中心碳代谢 [17]。而本研究通过 GSEA 富集分析发现高原低氧条件下碳代谢通路被明显抑制，这与之前的研究报道肿瘤中缺氧微环境诱导中心碳代谢重编辑一致。机体中心碳代谢异常会导致线粒体功能障碍 [18]，机体对营养物质的消化、吸收、排泄等出现病理性不平衡状态，容易导致各种疾病的发生，如高血压、高血糖、高血脂、高尿酸症等代谢性疾病、神经系统疾病和癌症等 [19 - 21]。为了探究低氧胁迫导致碳代谢异常的分子机制，本研究选取了碳代谢通路 3 条经典途径中 PGAM2、ENO3、PRPS2、PGLS、RPE、IDH3A、SUCLA2、MDH2 8 个关键基因和蛋白进行 mRNA 和蛋白表达量检测，发现低氧暴露 30d 后，HST 组较 PSC 组，基因和蛋白表达量均下调。

　　EMP 途径是将葡萄糖在一系列酶的催化下分解为丙酮酸并产生能量的过程。机体组织细胞在有氧和无氧条件下均可通过 EMP 途径来获得能量。磷酸甘油酸变位酶 2(PGAM2)是 EMP 途径中的一种重要酶，可催化磷酸基团从 3 - 磷酸甘油酸转移到 2 - 磷酸甘油酸 [22]。PGAM2 可以在协调通过 EMP 产生的能量、产生的还原力、生物合成氨基酸、5 - 碳糖(用于合成 RNA 和 DNA 的核苷酸的前体)的能量产生等方面发挥作用。烯醇化酶(ENO3)是一种二聚体酶，可将 2 - 磷酸甘油酸烯醇化为磷酸烯醇式丙酮酸，进而转化为丙酮酸，作为 EMP 途径的一部分。本次 RT - qPCR 实验和 Western blot 实验结果均显示低氧刺激导致 PGAM2、ENO3 表达下调，提示高原低氧胁迫会导致 EMP 途径发生改变。

　　PPP 由葡萄糖直接氧化起始，产生大量的 NADPH，为细胞的各种合成反应提供还原剂，在细胞营养代谢和大分子生物合成方面起着至关重要的作用 [23]。磷酸核糖焦磷酸合成酶 2(PRPS2)是一种限速酶，具有镁离子结合活性、嘌呤核苷酸结合活性、核糖磷酸二磷酸激酶活性，参与 5 - 磷酸 2 - 磷酸生物合成过程。PRPS2 不仅是嘌呤生物合成酶，也是偶联蛋白和核苷酸生物合成的限速酶。有报道称，PRPS2 介导的嘌呤代谢与缺氧、先天免疫应答、肿瘤葡萄糖剥夺以及维持脑肿瘤起始细胞有关 [24]。6 - 磷酸葡萄糖酸酯酶(PGLS)是磷酸戊糖途径的关键酶，可水解 6 - 磷酸 - δ - 葡萄糖酸内酯生成 6 - 磷酸葡萄糖酸(6PG)。有研究表明，核糖 - 5 - 磷酸 - 3 - 差向异构酶(RPE)催化核酮糖 - 5 - 磷酸和木酮糖 - 5 - 磷酸的相互转化，参与细胞碳水化合物代谢过程、磷酸戊糖分解代谢过程 [25]。本研究中，与 PSC 组相比，HST 组 PRPS2、PGLS、RPE 的基因和蛋白表达水平均呈现下调趋势，提示高原低氧环境下 PPP 途径被抑制。

　　TCA 循环是碳水化合物、脂肪、氨基酸等的最终共氧化过程，TCA 的中间产物是表观遗传修饰的重要底物，在多种结构中表达，为许多生物合成途径提供前体物质。异柠檬酸脱氢酶 3(IDH3A)将异柠檬酸氧化脱羧生成 α 酮戊二酸，是循环中的限速酶，IDH3A 位于线粒体和髓鞘中，在多种结构中表达，包括消化系统、中枢神经系统、泌尿生殖系统、呼吸系统、和感觉器官。有研究表明，IDH3A 活性降低导致视网膜变性和线粒体功能降低 [26]。线粒体功能障碍可引起氧化应激甚至导致细胞死亡 [21]。琥珀酸辅酶 A 连接酶(SUCLA2)催化琥珀酰辅酶 A 转化为琥珀酸，具有稳定线粒体核苷酸二磷酸激酶的功能，ALKHATER 等人发现 SUCLA2 突变是导致脑肌病和线粒体 DNA 耗竭的原因之一 [27]。苹果酸脱氢酶 2(MDH2)被称为典型的 NAD + 依赖性脱氢酶 [28]，已有研究证实，与辅酶 NADH 或 NAD + 结合后将苹果酸催化为草酰乙酸，MDH2 在脓毒性急性肺损伤组织中表达显著降低 [29]。本研究 HST 组 IDH3A、SUCLA2、MDH2 基因和蛋白表达水平均明显低于 PSC 组，提示高原低氧胁迫会导致 TCA 循环受到抑制。

　　低压低氧环境是影响新陈代谢的关键因素之一，新陈代谢受到正常细胞营养吸收和代谢的严格调控，葡萄糖作为细胞的主要能量来源，对细胞生理学至关重要 [30]。碳代谢是产生能量的重要途径，对机体能量代谢活动至关重要，是维持生物体细胞生长最基本的代谢活动，以上研究表明，低氧胁迫会导致碳代谢通中关键基因和蛋白表达下调，提示高海拔地区会导致哺乳动物碳代谢通路受到抑制，进而使机体能量代谢发生紊乱。

　　综上所述，本研究通过转录组测序、蛋白质组学和非靶向代谢组学测序分析发现高原低氧胁迫下大量与碳代谢通路相关的 DEGs、DEPs 和 DEMs，通过 KEGG 富集分析发现 DEGs、DEPs 和 DEMs 在碳代谢、能量代谢、氧化磷酸化等通路显著富集，在 GO 注释分析中也发现了类似结果。随后，通过 RT - qPCR 和 Western blot 检测发现碳代谢通路中 PGAM2、ENO3、PRPS2、PGLS、RPE、IDH3A、SUCLA2、MDH2 等关键基因和蛋白表达水平下调，提示高原低氧条件抑制碳代谢通路，导致机体代谢失衡、氧化损伤。本研究丰富了高原低氧条件下机体碳代谢发生改变的分子机制，为低氧胁迫下能量代谢紊乱提供了新的理论依据。

陈晓晨;胡 英;许玉珍;龙启福;马茹雪;永 胜,青海大学医学院基础医学部免疫学教研室,202405