中华泌尿外科杂志投稿格式参考范文：抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的制备及鉴定

　　前列腺干细胞抗原 (PSCA) 被认为是用于前列腺癌免疫病理诊断、特异性免疫定位显像诊断和免疫靶向治疗的最有意义的靶抗原 [1]。为了更好地探索肿瘤发生发展及转移的分子机理，更有效地进行肿瘤的诊断治疗，我们制备出抗 PSCA 的鼠抗人单克隆抗体，并对其特异性进行了初步鉴定。现报告如下。

　　材料与方法

　　免疫用抗原：表达、纯化的融合蛋白 PSCA 作为免疫用抗原 [2]。

　　杂交瘤细胞的制备：免疫用 Balb/c 小鼠购自中科院上海动物所，雌性，8 周龄。用纯化的 PSCA 按每只小鼠 100μg 剂量的抗原与弗氏完全佐剂等量混匀，在小鼠颈背部皮下多点注射或腹腔注射，2~4 周后，取同量抗原加不完全佐剂追加免疫 1 次，再间隔 4 周，取同量抗原不加佐剂经腹腔追加免疫。融合前 3d 用 100μg PSCA 腹腔注射加强免疫。取免疫小鼠脾细胞与 SP₂/0 小鼠骨髓瘤细胞在 50% PEG 作用下融合，HAT 培养液选择性培养。5d 左右见有明显的克隆生长，杂交细胞较大，呈圆形且透明，其他细胞透光性差并逐渐死亡。

　　克隆化培养和检测：采用有限稀释法进行克隆化培养，对阳性单克隆再克隆化培养，直到 100% 的克隆分泌特异性抗体为止。采用间接 ELISA 法，对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，选出与 PSCA 反应阳性的杂交瘤细胞。

　　腹水型单克隆抗体制备：将所获阳性克隆的杂交瘤细胞按 2×10⁵/m 接种到 7~10d 前已注射过石蜡油的 Balb/c 小鼠腹腔，10~15d 后收集腹水。

　　单克隆体亚类的鉴定：单克隆抗体培养上清液浓缩后与抗鼠 IgG 亚类血清作双扩散实验。

　　Western blot 检测：用 Bio-Rad 半干式电转移装置进行电转移，取出 NC 膜，丽春红 S 染色，漂洗后标出标样位置。将 NC 膜放入 1×NET-Gelatine 缓冲液封闭。加入鼠抗人 PSCA 多抗(1∶200 稀释)，室温作用 2h。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(1∶10000 稀释)，室温作用 1h。加入新鲜配制的荧光显色液，室温作用后封入保鲜膜中压片，放射自显影 1~5min。

　　EnVision TM 免疫组化检测：用纯化的腹水型单克隆抗体，采用二步法系统(即 EnVision)[3] 检测 40 例前列腺癌组织，10 例良性前列腺增生组织以及 5 例正常前列腺组织。正常前列腺标本取自意外死亡的 20~25 岁男性。良性前列腺增生及前列腺癌组织取自我院经病理证实的手术标本。组织离体后 10% 中性福尔马林浸泡过夜，梯度酒精脱水、二甲苯透明处理后石蜡包埋，常温保存。结果判断：每张切片随机观察 20 个高倍视野或高倍镜下记数 1000 个细胞(正常前列腺、前列腺增生上皮的基底细胞以及前列腺癌细胞)，阳性结果判断参照 Remmele 和 Stegner [4] 提出的免疫反应积分(IRS)，兼顾阳性细胞染色范围的百分比(PP)及阳性染色强度(SI)。将阳性细胞的百分比分为 5 级，无阳性细胞为 0 分，阳性细胞占视野内同类细胞总数的≤25% 计 1 分，26%~ 计 2 分，51%~ 计 3 分，>75% 计 4 分;PSCA 染色强度评定如下：前列腺上皮基底细胞、前列腺癌细胞膜、前列腺腺泡及腺管上皮细胞膜无染色为阴性(-)，为 0 分;呈淡黄色，为(+)、1 分;淡黄色棕黄色为(++)、2 分;棕褐色为(+++)、3 分。不同组织中 PSCA 表达采用 one-ANOVA 进行统计学分析。

　　结果

　　杂交瘤细胞株的建立：含阳性血清的小鼠脾脏细胞与 SP₂小鼠骨髓瘤细胞融合经 HAT 选择性培养，5d 左右见有明显的克隆生长，在杂交瘤细胞布满孔底 1/10 时，取上清用间接 ELISA 法重复筛选后克隆化培养获株阳性细胞 D3。将培养上清液浓缩后进行亚类鉴定为 IgG1。

　　单克隆抗体特异性鉴定：Western blot 结果显示，与 D3 抗 PSCA 单抗反应后，膜上出现棕色的条带(图 1)。与其他蛋白因子无交叉反应。

　　免疫组化结果：38 例前列腺癌、10 例 BPH 及 5 例正常前列腺组织标本中，D3 单抗免疫组化染色阳性;2 例前列腺癌标本呈阴性染色。阳性染色可见于正常前列腺上皮基底细胞、前列腺增生上皮的基底细胞、前列腺癌细胞胞膜，染色淡黄至棕褐 PSCA 蛋白在正常前列腺、良性前列腺增生、前列腺癌组织中的阳性表达率分别为 60.3%、69.2%、87.6%;强阳性染色分别为 3.0%、10.0%、22.5%。前列腺癌组织染色强度、范围与正常前列腺和良性前列腺增生组织差异有统计学意义(P<0.01);正常前列腺和良性前列腺增生组织染色强度、范围差异无统计学意义(P>0.05)。

　　讨论

　　自从 1975 年 Kohler 和 Milstein [5] 创建了 B 细胞杂交瘤技术以来，McAb 制备技术已被人们接受和广泛应用。本研究选用小鼠骨髓瘤 Sp2/0 细胞株与免疫了 PSCA 抗原的 BALB/c 小鼠脾细胞融合，形成杂交瘤细胞。通过阳性克隆有限稀释方法，去除不能分泌抗体或分泌的抗体效价不高的细胞，保留高分泌抗体型的杂交瘤细胞，至 4~5 次克隆阳性细胞占到全部培养孔的 90% 以上时，收集全部的杂交瘤细胞注入健康小鼠的腹腔中制备腹水型 McAb。杂交瘤技术周期长、难度大，需要注意：①选择生长良好的骨髓瘤细胞供融合用，有利于融合;②PSCA 是一种不完全抗原，应加弗氏完全佐剂，以增加免疫效果。

　　单克隆抗体是抗单一抗原决定簇的，可避免与其它产生交叉反应，因此利用单克隆抗体所建立的检测方法具有特异、灵敏、准确的优点，避免假阳性和假阴性，制成 ELISA 检测试剂盒，适于临床诊断。已有的研究表明，PSCA 有 3 个抗原决定簇 [6]，我们得到的单抗只识别其中 1 个抗原决定簇，由于其他原因造成可识别的抗原没有暴露，单抗检测时会出现假阴性结果，因此，进行组织标本免疫病理检测时最好将识别不同抗原决定簇的多个单抗混合共同检测，以减少假阴性结果。

　　我们制备的抗 PSCA 单抗 D³ 在正常前列腺组织、良性前列腺增生组织及前列腺癌细胞膜上均有阳性反应，不同组织染色强度和范围亦不同;前列腺癌组织染色强度、范围与正常前列腺和良性前列腺增生组织存在明显差异，正常前列腺和良性前列腺增生组织染色强度、范围无明显差异。Western blot、ELISA 及免疫组化检测结果表明这株单抗所识别的抗原为前列腺干细胞抗原，表明 D³ 在前列腺癌的放射免疫显像诊断及导向治疗上有应用价值。由于 PSCA 是一种前列腺细胞特异的细胞膜蛋白，尤其是在前列腺癌骨转移灶细胞中高表达，而被认为在前列腺癌特异性放射免疫显像诊断及导向治疗方面具有重要的临床意义 [7]。虽然 D3 与正常前列腺上皮细胞也呈阳性反应，但考虑到老年患者前列腺的功能特点，PSCA 单抗导向治疗可不必过多顾及对正常前列腺组织造成的损伤。

许传亮;顾正勤;高旭;孙颖浩;黄盛东;龚德军,第二军医大学附属长海医院泌尿外科,200627