中华临床感染病杂志投稿格式参考范文：靶向高通量测序技术应用于感染性疾病专家共识

　　引言

　　近年来，全球感染性疾病仍是人类健康的主要威胁之一。在治疗感染性疾病时，准确和及时的病原学诊断至关重要。然而，传统的病原体检测方法存在各种局限性，如培养耗时长、阳性检出率低;免疫学方法准确度有待提升;聚合酶链反应(PCR)技术检测覆盖病原体有限;Sanger 测序技术通量小、速度慢、成本高。

　　高通量测序技术为病原体检测提供了新可能，包括宏基因组二代测序(mNGS)和靶向高通量测序(tNGS)。mNGS 在感染性疾病病原体快速诊断方面有优势，但高成本、易受宿主核酸干扰等因素阻碍其临床广泛应用。tNGS 基于多重 PCR 扩增或探针靶向捕获，能选择性扩增或富集目标片段，同时检测多种病原体，成为高效、经济且准确的病原体检测工具。目前，tNGS 在感染性疾病病原体检测中潜力较大，为规范其临床应用，制订本共识，采用 2011 版牛津大学循证医学证据分级与推荐意见强度分级方法，形成 24 条建议。

　　1.临床适应证

　　建议 1：对于疑似下呼吸道感染的非重症患者，满足传统微生物检测未明确病原体、经验性抗感染治疗 2 - 3 d 效果不佳、属于高危人群(儿童、老年人、孕妇、肥胖和存在基础疾病等)这三个条件之一，建议进行 tNGS 检测。下呼吸道感染病原体类型复杂，tNGS 在检测病原体、识别非典型病原体和混合感染方面优势显著，且在检测常见病原体时与 mNGS 相当，但检测效率和成本效益更高，对下呼吸道感染的抗感染治疗有指导价值。此外，tNGS 在儿童肺炎支原体感染诊断中准确性良好，还可检测耐药基因突变位点。

　　建议 2：对于疑似中枢神经系统感染的非重症患者，若经验性抗感染治疗 2 - 3 d 效果不佳、传统微生物检测结果阴性(脑膜炎、脑脊髓膜炎、脑炎和疑似颅内感染占位性病变)或为新生儿，建议进行 tNGS 检测。传统脑脊液培养阳性率低，tNGS 在检测中枢神经系统感染病原体方面准确率、敏感度和特异度更高，诊断时间和成本效益也有优势。

　　建议 3：对于疑似血流感染(BSI)的非重症患者，当传统微生物检测结果阴性、经验性抗感染治疗 2 - 3 d 效果不佳，或属于儿童、孕妇、老年人以及存在基础疾病的高危人群，建议进行 tNGS 检测。BSI 是危及生命的全身性感染疾病，tNGS 有望快速准确识别病原体，帮助临床诊断和治疗。研究显示，血液 tNGS 对 BSI 诊断敏感度更高，检测周转时间更快，部分患者根据检测结果调整治疗后病情改善。

　　建议 4：对于疑似泌尿系统、脊柱关节感染的患者，若传统微生物检测结果阴性、经验性抗感染治疗 2 - 3 d 效果不佳，建议进行 tNGS 检测。tNGS 在关节假体感染诊断中的敏感度和特异度与培养和 mNGS 相当，且在成本和检测周转时间方面更优。tNGS 检测尿路感染病原体具有快速、灵敏和全面的优势，可作为传统检测方法的有效补充，在复杂和混合感染的尿路感染性疾病中，能识别多种微生物并提供更详细诊断信息。

　　建议 5：对于结核分枝杆菌等耐药基因与表型一致性较高的物种，若需进行耐药检测，建议采用 tNGS 检测方法。tNGS 针对结核分枝杆菌耐药基因的预测是判断其耐药性的重要依据，与传统方法相比，能更快速识别结核分枝杆菌的谱系和耐药性，对结核分枝杆菌的检出率较高，且与全基因组测序(WGS)检测结果高度一致，可为耐药结核病治疗提供临床信息。

　　建议 6：对于传统方法检测病原体尚未明确且病因不明的危重症患者、病因不明的免疫功能缺陷或抑制患者、社区聚集疑似新发病原体暴发流行的病例，优先考虑 mNGS 送检。免疫功能抑制患者感染病原体复杂，mNGS 覆盖病原体更广泛、临床符合率高，能发现更多感染情况。在社区性感染暴发时，mNGS 病原体覆盖更广，可帮助尽快明确病原体，采取防控措施。

　　建议 7：tNGS 检测结果判读需结合患者病情、标本类型和实验室检测结果，必要时结合文献资料综合判读;对于病情严重且病因不明的患者，建议感染科、病原微生物团队及相关临床科室多学科会诊。多标本检测可为致病菌判断提供更多参考信息，多学科会诊有助于确定感染病因，分析微生物群落关系。

　　2. tNGS 的实验流程建议

　　建议 8：尽量在使用抗菌药物治疗前，采集临床疑似感染患者的样本，并且优先选择采集感染部位的样本。实验室需对来自疑似感染部位的各种类型样本建立完整的前处理流程，充分保障生物安全性。如怀疑下呼吸道感染，尽可能采集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行检测;不同样本采集有不同要求，采集后需及时送检，实验室收到样本后要记录信息并注意生物安全和样本预处理。

　　建议 9：实验室应针对不同类型样本、特殊病原体(如胞内特殊病原体或真菌等厚壁病原体)等建立相应的核酸提取流程，并设立阴性对照和阳性对照。核酸质量是高通量测序成功的关键，需根据病原体类型选择合适样本处理和核酸提取方法，常用方法有柱提法和磁珠法，还可结合其他裂解方法提高样本裂解效率，同时要对核酸进行纯度和浓度评估，注意防止 RNA 降解。

　　建议 10：基于探针捕获技术和多重 PCR 技术的 tNGS 各有优缺点，实验室需要根据具体的临床需求、适用场景、样本类型、预期的病原体种类和数量、实验室的设备和技术水平等因素进行综合考虑选择。基于探针捕获技术的 tNGS 适合已知病原体检测，尤其是苛养和低载量病原体;基于多重 PCR 技术的 tNGS 实验步骤简单快捷，但稳定性相对较低。

　　建议 11：生物信息学分析中，应对分析流程及时进行更新与优化，对于病原体数据库，应选择高质量文献报道及行业认可的公共数据库，并结合实验室自身情况进行参数调整，以确保准确报告致病病原体。生物信息学分析流程需经过细致评估，包括对照组和患者数据集的分析比较，通过常规实验室结果确认最终结果准确性，且要详细记录所使用的生物信息学方法。

　　3. 质量控制

　　建议 12：实验室应通过合理的布局、环境洁净度控制、单向工作流程、严格的去污染方案和对照的设置等降低污染风险，尤其采用专用操作空间，以最大程度减少气溶胶污染。tNGS 检测的最大挑战是污染导致的假阳性，污染来源包括实验室试剂、环境中的背景微生物和气溶胶污染等，因此操作人员需训练有素，样品处理过程要格外小心，同时各实验室应采取去污染方案控制交叉污染。

　　建议 13：实验室的核酸提取流程(手工法或者试剂盒法)应经过验证;测序原始数据应进行质量控制，确保测序原始数据的质量。不同测序平台产生不同读长，实验室应根据平台及样本类型选择合适试剂盒和检测流程，对合成寡核苷酸材料的来源、质量和数量进行质控，数据与序列管理需要检验医师、临床医师综合团队参与。

　　建议 14：建议下机数据中单样本平均数据量≥1 M，识别正确率超过 99.9% 的碱基占比(Q30)≥85%。测序数据量关系到 tNGS 诊断的敏感度和特异度，较高数据量可提高低丰度病原体检出率，减少假阳性和假阴性结果，提高诊断准确性。

　　建议 15：tNGS 技术中阳性阈值的设定对于确保检测的敏感度、特异度和临床意义至关重要，需基于实验数据、统计分析、临床意义、病原体特性、样本类型、测序平台、生物信息学数据库、质控标准及相关标准或指南等，并保证结果的可重复性。各实验室应根据自身检测流程，结合多种因素设定相应阳性阈值，确保结果符合行业规范。

　　建议 16：建议对整个检测和分析流程中的参考样品(代表物种)的检出限、精密度、准确性、稳定性及重复性等进行确认。确认这些性能可确保实验室检测性能，通过使用阴性、阳性质控和标准参考品，在不同时间点、不同操作人员和不同仪器上重复实验完成，还应进行方法比较研究，评估检测流程中的偏差和干扰因素，比较 tNGS 结果与传统微生物学方法和其他分子诊断技术的一致性。

　　建议 17：实现 tNGS 医疗机构本地化检测能够较好地进行实验室管理与人才培养，提高对抗传染病的应急响应能力。医院内部建立检测平台可提升技术和运营水平，满足特定临床需求，缩短样本处理和结果报告时间，有助于控制传染病传播和指导临床治疗，但也面临技术人员质控意识、仪器设备校准等挑战。

　　4. 报告解读

　　建议 18：tNGS 结果的报告应包含患者和送检机构的基本信息、详细的 tNGS 检测方法、检测范围、检测结果及其解释、质量控制措施、专业的报告格式、结论和建议、报告解释权和联系方式，以及相关的参考文献。报告内容应详细准确，为临床诊断提供全面信息。

　　建议 19：为确保 tNGS 检测的准确性，可使用质控品建立背景微生物数据库和排除环境污染等情况。通过阴性质控品和阳性质控品进行质控，阴性质控品检测结果应为阴性，阳性质控品应正确检出对应病原体，否则实验检测结果无效。

　　建议 20：测序完成后，应全面进行样本和实验流程的质控，包括下机数据量、数据质量、内参、阴性及阳性质控等。质控合格后再进行分析，使用比对工具将过滤后的读段与参考病原体数据库比对，对检出物种进行注释。

　　建议 21：理论上标准化后的物种(种或型或亚型)SDSMRN 高于其对应类别的阳性判断阈值则视为检出，同时考虑微生物自身特点及患者临床实际情况。检出病原微生物需综合多种因素判断，检出序列数可能不足以反映病原体真实情况，应结合临床实际和其他检测结果判断是否为致病微生物。

　　建议 22：报告中某种 / 某些胞内菌(如结核分枝杆菌)/ 厚壁菌(真菌，如曲霉等)检出序列数不高时，需要结合患者临床症状及其他检测结果综合判断。低序列数可能是破壁技术问题导致 DNA 释放不充分，因此需综合多种检测进行准确诊断。

　　建议 23：tNGS 结果判读为阴性，应该结合整体检出情况综合判断，不能作为排除感染标准。tNGS 靶标有限，阴性结果也可能存在其他非靶标病原体感染，且检测结果受多种因素影响，临床医师应综合考虑。

　　建议 24：采用 tNGS 进行耐药基因 / 毒力因子鉴定时，需要明确耐药 / 毒力基因型不等于表型，最终结果还应结合实验室检测结果进行验证。对于耐药基因与表型一致性较高的物种，基因分型结果可作为用药指导，但对于许多微生物，tNGS 检测结果仅作参考，需结合实验室结果和临床实际情况判断。

　　5. 总结与展望

　　tNGS 在病原体诊断中潜力巨大，可精准识别多种病原体，适用于复杂或混合感染，还能检测病原体耐药基因，推动精准医学发展，但对于基因型与表型关系不明确的病原体，耐药基因检测与临床表现可能不一致，需整合数据库深入研究耐药机制。随着测序技术发展，靶向长读长测序可提高拼接完整性和准确性，用于病原体识别和追踪，但目前成本较高。总体而言，tNGS 成本逐渐降低，应用领域将更广泛，有望成为常规临床诊断工具，在全球发挥重要作用，但检测结果需结合传统微生物学诊断技术及临床综合分析判读。

卢洪洲,深圳市第三人民医院;南方科技大学附属第二医院,202406