骨髓间质干细胞成骨分化过程中分泌外泌体对Raw264.7巨噬细胞极化及骨再生的影响

来源：中华骨科杂志2025年第19期北京时间：

作者：甄冠棋,武锋,于恩明,闫景龙,宋成超

单位：哈尔滨医科大学附属第二医院,哈尔滨医科大学附属第二医院,哈尔滨医科大学附属第二医院,哈尔滨医科大学附属第二医院,哈尔滨医科大学附属第二医院

摘要：目的 探讨骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在成骨分化过程中分泌的外泌体对Raw264.7巨噬细胞极化及骨再生的影响和潜在作用机制。方法 在Raw264.7巨噬细胞中分别加入PBS、未成骨诱导的BMSCs条件培养基（CM）、成骨诱导7 d、14 d、21 d的BMSCs条件培养基。作用于Raw264.7细胞48 h后，采用Western-blot检测比较各组巨噬细胞M1型标志物[诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、CD86]与M2型标志物[精氨酸酶（arginase，ARG）-1、CD163]蛋白表达水平。另将Raw264.7巨噬细胞分为三组：PBS组，仅加入PBS；BMSCs-exo组，加入未分化BMSCs来源外泌体；7D-BMSCs-exo组，加入成骨诱导7 d的BMSCs来源外泌体。使用酶标仪检测各组Raw264.7细胞在24 h、48 h、72 h的吸光度值。采用Western-blot检测外泌体处理后Raw264.7巨噬细胞的M1或M2型标志物蛋白表达变化。将三组Raw264.7巨噬细胞上清与BMSCs共培养，采用茜素红染色定量矿化结节形成、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色评价早期成骨活性，并检测成骨相关蛋白Runx2、ALP、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙素（osteocalcin，OCN）的表达水平。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）迁移能力采用划痕实验检测迁移距离，血管生成能力采用体外成血管实验检测血管环数量，并通过Western-blot检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-A和血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）的表达。MAPK信号通路的激活水平通过检测p-P38、p-ERK1/2及其总蛋白的表达情况进行评估。结果 Western-blot结果显示，BMSCs成骨分化7 d来源的条件培养基（7D-BMSCs-CM）诱导Raw264.7巨噬细胞向M2型极化最显著，与PBS组相比7D-BMSCs-CM组ARG-1和CD163蛋白表达分别上调至1.36±0.09和1.69±0.09（ <0.05），而iNOS和CD86蛋白表达分别下降至0.21±0.03和0.29±0.03（ <0.05）。7D-BMSCs-exo组巨噬细胞的吸光度值在24 h、48 h、72 h时均较PBS组提高（ <0.05）。与BMSCs-exo组相比，7D-BMSCs-exo组上调CD163、ARG-1表达，抑制iNOS、CD86表达（ <0.05）。7D-BMSCs-exo组茜素红染色呈更强的红色沉积，矿化程度高；ALP染色强度亦同步增强；Western-blot结果显示Runx2、ALP、OPN、OCN蛋白表达均较PBS组高（ <0.05）。划痕实验结果显示，7D-BMSCs-exo组EPCs 24 h细胞迁移相对距离达到（2.30±0.05） μm，较PBS组（1.10±0.02） μm提高（ <0.05）。Tube formation实验显示，EPCs血管环数量高于PBS组（30.3±2.5和15.0±1.0， <0.05），VEGF-A和PDGF蛋白表达上调。Western-blot结果显示，7D-BMSCs-exo组p-P38和p-ERK1/2的表达水平较PBS组分别降至0.40±0.06和0.25±0.06（ <0.05）。 结论 BMSCs在成骨分化过程中分泌的外泌体能够诱导Raw264.7巨噬细胞向M2型极化，尤其在成骨分化第7天时作用最为显著。M2型巨噬细胞极化不仅可增强BMSCs的成骨分化能力，还能促进EPCs的血管生成，这一过程与MAPK信号通路被抑制密切相关。

关键词：骨髓;间质干细胞;外泌体;巨噬细胞;骨再生

基金资助：国家自然科学基金82402860，U23A20412