低氧培养BMSCs的外泌体促进软骨再生的机制研究

来源：中华骨科杂志2023年第12期北京时间：

作者：沈凯,翟晨骏,左强,梁文卫,范卫民,刘锋

单位：江苏省人民医院,宜兴市人民医院,江苏省人民医院,江苏省人民医院,江苏省人民医院,江苏省人民医院

摘要：目的 探讨低氧培养骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）来源的外泌体中miR-196b-5p对软骨细胞功能的影响及作用机制，并分析其在软骨再生修复中的应用。方法 将软骨细胞分别在常氧培养和低氧培养的BMSCs上清液中培养，通过CCK-8检测软骨细胞的增殖能力，qPCR检测Ⅱ型胶原（collagen type 2，Col2）、Col1、Aggrecan、 的表达情况，评估低氧培养后BMSCs的外泌体对软骨细胞功能的影响。通过超速离心法获取常氧外泌体和低氧外泌体，采用CCK-8和qPCR检测对比低氧BMSCs外泌体和常氧BMSCs外泌体对软骨细胞增殖及合成代谢相关基因表达的促进作用。验证外泌体miRNA测序结果中低氧外泌体miR-196b-5p的表达情况，敲除低氧BMSCs中miR-196b-5p进行功能抑制实验，对比miR-196b-5p在低氧外泌体促进软骨细胞功能中发挥的作用。使用生物信息学工具预测并验证miR-196b-5p下游靶点。通过转染siRNA分析低氧BMSCs外泌体中miR-196b-5p促进软骨细胞功能的作用机制。采用丝素水凝胶负载低氧外泌体及低表达miR-196b-5p的低氧外泌体，注入裸鼠皮下后培养4周后对取出的组织块行番红O、马松组织学染色及硫酸糖胺聚糖、胶原生化含量检测，评估低氧外泌体及miR-196b-5p在软骨再生修复中的应用情况。 结果 低氧组软骨细胞吸光度为1.20±0.07，较常氧组的0.94±0.04高，差异有统计学意义（ <0.05）；低氧组软骨细胞Col2（2.95±0.17）、Aggrecan（2.45±0.27）、 （2.92±0.29）的表达高于常氧组（1.89±0.09、1.67±0.21、1.76±0.16），差异有统计学意义（ <0.05）。CCK-8示低氧外泌体组软骨细胞的增殖能力（1.28±0.04）较常氧外泌体组（1.05±0.06）更高，差异有统计学意义（ <0.05）。PmirGLO-BACH1-WT报告载体与miR-196b-5p mimics共转染后（0.73±0.06）的荧光素酶活性降低，差异有统计学意义（ <0.05）；PmirGLO-BACH1-MUT报告载体与miR-196b-5p mimics共转染后，荧光素酶活性无变化，BACH1为miR-196b-5p下游靶点；裸鼠皮下组织培养生化含量分析显示低氧BMSCs外泌体组软骨基质sGAG（383.2±21.54）和胶原含量（67.40±3.45）增多，低氧BMSCs外泌体miR-196b-5p敲低组sGAG（258.4±19.50）和胶原含量（57.15±4.95）降低，差异均有统计学意义（ <0.05）。 结论 低氧外泌体通过miR-196b-5p抑制软骨细胞中BACH1的表达，促进软骨细胞功能，可应用于软骨再生修复。

关键词：骨髓间充质干细胞;低氧;外泌体;miR-196b-5p;软骨再生

基金资助：国家自然科学基金项目81974332；82202716