还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶-4在成骨细胞凋亡中的作用

来源：中华骨科杂志2018年第12期北京时间：

作者：张华峰,白树财,徐倩,李晖,李东,李呈凯,宋秀钢,秦亚飞,马信龙

单位：天津医科大学总医院,天津医科大学,天津中医药大学,天津医科大学总医院,天津医科大学总医院,天津医科大学,天津医科大学,天津医科大学,天津市天津医院

摘要：目的 探讨高浓度地塞米松（dexamethasone，DEX）激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-reduced，NADPH）氧化酶-4（NADPH oxidase 4，Nox4）途径产生氧自由基对成骨细胞凋亡的影响和作用机制。方法 设正常对照组，DEX组，DEX+N-乙酰半胱氨酸（n-acetylcysteine，NAC）组，NAC组，DEX+二亚苯基碘(diphenyleneiodonium chloride，DPI）组，DPI组。干预培养24 h后，倒置显微镜下观察成骨细胞形态；MTT法检测细胞活性；荧光探针DCFH-DA检测细胞内氧自由基水平；Hoechst染色检测成骨细胞凋亡；荧光定量PCR及Western-Blot检测Nox4/NADPH氧化酶基因和蛋白的表达；Nox4 siRNA沉默细胞内Nox4/NADPH氧化酶表达后，通过荧光探针检测氧自由基水平。结果 采用1 000 nmol/L地塞米松处理成骨细胞，按照实验分组干预培养24 h，倒置相差显微镜下观察和MTT结果提示，与正常对照组相比，DEX组成骨细胞出现明显的皱缩、变形，细胞存活率显著降低，加入NAC或DPI后细胞形态良好，生长旺盛。荧光探针检测结果显示，DEX组成骨细胞内氧自由基生成（45.14%±1.49%）与正常对照组（5.86%±0.28%）相比，差异有统计学意义（ =0.000）；Hoechst染色结果显示，DEX组成骨细胞凋亡（29.60%±1.52%）与正常对照组（4.12%±0.67%）相比，差异有统计学意义（ =0.000）。DEX组成骨细胞内氧自由基生成与DEX+NAC组（28.06%±1.61%）和DEX+DPI组（23.70% ±1.28%）相比，差异均有统计学意义（均 =0.000），提示NAC或DPI显著降低了成骨细胞内氧自由基的产生。DEX组成骨细胞凋亡与DEX+NAC组（8.94%±1.47%）和DEX+DPI组（12.96%±2.03%）相比，差异均有统计学意义（均 =0.000），提示NAC或DPI显著降低了成骨细胞凋亡。Nox4的荧光定量PCR显示DEX组Nox4的基因表达是正常对照组的2.67倍（ =-10.301， =0.009），Western Blot检测显示DEX组Nox4的蛋白表达是正常对照组的2.37倍（ =-15.542， =0.004），差异有统计学意义。进一步通过Nox4 siRNA靶向沉默Nox4的表达，DEX+Nox4 siRNA组成骨细胞内氧自由基的生成（14.53%±1.00%）比DEX组（31.45%±0.72%）降低了16.92%，两者比较差异有统计学意义（ =0.000）。 结论 Nox4介导的氧自由基生成在高浓度地塞米松诱导成骨细胞凋亡过程中起重要作用，Nox4可能是糖皮质激素性股骨头坏死治疗过程中的重要靶点。

关键词：地塞米松;细胞凋亡;活性氧;NADPH氧化酶

基金资助：天津中医药大学优秀教师培养计划81501915