中国组织工程研究杂志投稿格式参考范文：温敏抗菌水凝胶治疗感染性骨缺损

　　由开放性骨折、手术和慢性疾病等引起的感染性骨缺损常可导致肢体坏死、功能障碍，严重者甚至截肢，目前仍是临床治疗难题。当病原菌侵入骨骼系统时会导致局部持续性炎症反应和骨组织的破坏，阻碍骨再生，进而形成骨缺损。目前治疗感染性骨缺损把控制感染放在首要目标，传统治疗方法为彻底清创、抗生素浸渍的骨水泥填充后进行自体骨移植，但常常会出现抗生素浓度不足、耐药性产生等缺点;此外，长期进行抗生素治疗还会产生肾毒性及胃肠道不良反应。在骨重建方面，虽然自体骨移植是目前临床治疗的金标准，但也存在供体骨量有限及供区并发症的缺点。因此，为了在抗感染和骨再生之间实现平衡，寻求在感染部位局部可控释放抗生素并促进骨修复的双功能生物材料具有重要临床意义。

　　近年来，生物材料在组织工程中的应用受到了广泛关注。其中，水凝胶作为一种具有良好生物相容性和可塑性的材料，被广泛应用于药物递送来治疗感染性骨缺损。水凝胶的互连多孔结构有利于药物扩散，水凝胶的亲水性为局部组织提供了有利的微环境，并表现出与组织和细胞的良好亲和力。透明质酸是一种亲水性聚合物，具有无免疫原性、优异的生物相容性和抗蛋白质吸附性等特点，作为水凝胶和药物输送系统的成分在生物医学领域有着广泛应用。透明质酸具有多个反应性端基，可为各种药物和材料提供结合位点。氧化葡聚糖是一种生物可降解材料，由于可被人体组织代谢和降解而得到广泛应用。透明质酸和氧化葡聚糖可以通过简单混合的方法相互交联形成具有稳定性能的水凝胶，并且不需要额外的化学交联剂，具有良好的生物相容性，并且形成的水凝胶能够模拟细胞外基质，实现对细胞的高黏附性。万古霉素是一种三环糖肽抗生素，对成骨细胞分化没有毒性作用，并且能够有效杀死感染性骨缺损中最常见的病原体金黄色葡萄球菌，因此被广泛认为是治疗感染性骨缺损的首选抗生素 。透明质酸和氧化葡聚糖相结合的复合水凝胶，为感染性骨缺损局部递送万古霉素提供了一种优良的载体 。

　　此次实验将万古霉素负载于透明质酸 / 氧化葡聚糖复合水凝胶中构建了一种用于治疗感染性骨缺损的水凝胶药物缓释系统，拟通过细胞实验验证该水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化的影响，通过体外抗菌实验验证该水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制情况，并将该药物递送体系注射至家兔感染性骨缺损模型内，研究其在感染微环境下的治疗效果。

　　1材料和方法

　　1.1 设计

　　体外细胞实验、体内动物实验，组间比较进行 t 检验或单因素方差分析。

　　1.2 时间及地点

　　实验于 2022 年 8 月至 2024 年 2 月在西安交通大学附属第一医院实验室完成。

　　1.3 材料

　　1.3.1 细胞与菌种

　　兔骨髓间充质干细胞购自苏州赛业公司;大肠杆菌(E.coli，ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC25923)均购自上海市鲁微科技有限公司。

　　1.3.2 主要试剂

　　低糖 DMEM 培养基和胎牛血清购自 Gibco 公司;万古霉素购自西格玛奥尔德里奇(上海);青霉素链霉素双抗和胰蛋白酶 - EDTA(0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA)溶液购自 Sigma-Aldrich 公司;CCK-8、钙黄绿素 - AM-PI 染色试剂盒、RIPA 裂解缓冲液、BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒和碱性磷酸酶检测试剂盒均购自碧云天有限公司(中国上海);PBS、DAPI 溶液、TRITC 类淀粉样蛋白和 40g/L 多聚甲醛购自 Solarbio 公司(中国北京);兔骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基和茜素红染色剂购自 Cyagen 公司(美国圣克拉拉);FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit、ABScript Ⅱ RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover 和 Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 购自 Abclonal Co.(中国武汉);氯化十六烷基吡啶溶液(索莱宝，北京);RUNX2 和骨钙素抗体购自博奥森生物技术有限公司(北京);异硫氰酸荧光素(麦克斯玛生物科技有限公司，中国)。

　　1.3.3 主要仪器

　　紫外可见分光光度计(Shimadzu Company，Japan);扫描电子显微镜(Zeiss Sigma 300);流变仪(Anton Paar);荧光显微镜(Olympus FV 1000);Micro-CT 扫描仪(比利时，孔蒂奇 SkyScan 1076 扫描仪)。

　　1.3.4 实验动物

　　8 周龄雄性家兔 33 只，体质量 2.5-3.0kg，购自西安市中心医院动物实验中心，许可证号：SYXK(陕)2021-005。2 只 1 周龄新西兰乳兔购自西安市坊洲动物实验室。动物实验已获得西安市中心医院动物伦理委员会批准(批准号：院医伦 [2021] 52 号)。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的合成

　　将 50mg 透明质酸溶于去离子水中，制备 500mg/mL 的透明质酸溶液。将氧化葡聚糖溶于氢氧化钠溶液(100mg/mL)中，制备最终质量浓度为 20mg/mL 的氧化葡聚糖溶液。将透明质酸溶液和氧化葡聚糖溶液以体积比 1∶1 混合，将溶液的最终 pH 值调节为 7.2，随后将万古霉素加入到混合溶液中，最终万古霉素的质量浓度为 10mg/mL。以同样的方法制备不含有万古霉素的透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，作为对照组。

　　1.4.2 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的药物释放

　　将载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶与 PBS(pH=7.4)以 1∶4 的体积比一起注入离心管中，置于恒温培养箱中振荡(37℃、100r/min)。在预定好的间隔时间点，收集 1mL PBS，并加入等量全新的无菌 PBS。使用紫外可见分光光度计在 280nm 波长处测量收集 PBS 的吸光度值，计算药物累计释放率。

　　1.4.3 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的表征

　　将载万古霉素的透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶在 - 80℃下冷冻 6h，然后在 - 70℃下冻干 48h，以确保水凝胶中的水分充分排出，对样品进行喷金溅射涂层处理，通过扫描电子显微镜观察载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的表面形态。使用流变仪测定水凝胶的流动变形特性。在 25℃下将载万古霉素的透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶涂抹到流变仪板上，然后以 0.5℃/min 的速度加热，温度范围为 0-100℃，在恒定应变(0.1%)和频率(1Hz)条件下，使用流变仪测量水凝胶存储模量(G′)和损耗模量(G′′)的变化。

　　1.4.4 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的生物相容性

　　兔骨髓间充质干细胞的分离培养：取新西兰乳兔，脱颈处死后暴露四肢骨，用装有 1mL 低糖 DMEM 培养基的注射器对四肢骨髓腔反复冲洗，直至骨髓腔冲洗液变清亮，收集骨髓清洗液至培养皿中，反复吹打骨髓清洗液以消除细胞团，获得细胞悬液。将细胞悬浮在含有体积分数 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素的低糖 DMEM 培养基中，置于 37℃、体积分数 5%

　　CO2培养箱中孵育。传至第 3 代时用于后续细胞实验。细胞与水凝胶共培养：将兔骨髓间充质干细胞接种于 48 孔板中，细胞密度为

　　8×10孔，分 3 组处理：空白组不进行任何处理，对照组加入 200μL 透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，实验组加入 200μL 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，每组 3 复孔。

　　活死染色：培养第 1,3 天，去除培养基，将活 / 死染色液加入到孔板中，室温避光条件下孵育 30min，去除染色液，用 PBS 冲洗 2 次以去除多余的染色液，置于荧光显微镜下观察并拍照。

　　细胞增殖检测：培养 1,4,7d，每孔中加入 CCK-8 染色液，置于 37℃、体积分数 5% CO2培养箱中避光孵育 3h，使用紫外可见分光光度计在 450nm 处测量吸光度值。

　　1.4.5 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的体外促成骨性能

　　碱性磷酸酶染色：将兔骨髓间充质干细胞接种到 6 孔板中，细胞密度为 8×10 孔，在培养 24h 后观察到 80% 以上的细胞贴壁，更换为成骨诱导培养基，分 3 组处理：空白组不进行任何处理，对照组加入 1mL 透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，实验组加入 1mL 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，每组 3 复孔。成骨诱导培养 7d 后，40g/L 多聚甲醛固定细胞 30min，室温下加入 BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试避光孵育 1h，置于显微镜下观察并拍照。同时，用 RIPA 裂解缓冲液充分裂解各组细胞，12 000×g 离心 1min，收集上清液于 96 孔板中，依次加入显色底物和二乙醇胺缓冲液于 37℃孵育 30min，加入反应终止液，使用紫外可见分光光度计在 405nm 波长处测量吸光度值。

　　茜素红染色：将兔骨髓间充质干细胞接种到 24 孔板中，细胞密度为 2×10 孔，在培养 24h 后观察到 80% 以上的细胞贴壁，更换为成骨诱导培养基，分 3 组处理：空白组不进行任何处理，对照组加入 0.2mL 透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，实验组加入 0.2mL 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，每组 3 复孔。成骨诱导培养 14d 后，用 PBS 洗涤细胞 2 次，40g/L 多聚甲醛固定细胞 30min，每孔加入茜素红染液孵育 1h，用 PBS 漂洗样品 2 次以去除过量的染色液，置于显微镜观察下观察钙结节数量。同时，使用 10% 氯化十六烷基吡啶溶液溶解所有钙结节，使用紫外可见分光光度计在 540nm 处测量吸光度值。

　　RUNX2 免疫荧光染色：细胞接种与分组处理同茜素红染色。成骨诱导培养 14d 后，40g/L 多聚甲醛固定细胞 30min，用 PBS 润洗 3 次;用 0.1% TritonX-100 透化细胞 15min，用体积分数 10% 山羊血清封闭细胞 1h;加入 RUNX2 抗体(稀释比 1∶200)4℃下孵育过夜，加入山羊抗兔二抗(稀释比 1∶500)于 37℃下孵育 1h;加入 DAPI 染液对细胞核染色 5min，置于荧光显微镜下观察并拍照，使用 Image J 软件统计阳性细胞数量。

　　RT-qPCR 检测：细胞接种与分组处理同茜素红染色。成骨诱导培养 14d 后，使用快速提取法提取细胞总 RNA，对 RNA 的纯度进行检测。使用反转录试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA，随后使用 2×Fast SYBR Green Master Mix 在 LightCycler 480 上进行 qPCR 扩增，检测骨形态发生蛋白 2 与骨钙素 mNRA 表达。特异基因引物序列见表 1。以标准化 GAPDH 作为管家基因，使用

　　1.4.6 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的体外抗菌性能

　　将大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)放入 LB 培养基中，菌液浓度 1×10 CFU/mL，置于 37℃恒温振荡培养箱(振荡频率 120r/min)中孵育过夜，分 3 组处理：空白组不进行任何处理，对照组加入 0.2mL 透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，实验组加入 0.2mL 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，每组设置 3 个平行对照。培养 12,24,48h，吸取 100μL 细菌悬浮液到 96 孔培养板中，使用紫外可见分光光度计在 600nm 波长处检测吸光度值，绘制细菌生长曲线。

　　1.4.7 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的体内实验

　　感染性骨缺损动物模型的建立与分组干预：取 33 只家兔，腹腔注射 3% 戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后暴露左前臂桡骨，在桡骨中段截取长度为 1.5cm 的骨缺损，然后将浸泡在金黄色葡萄球菌悬浮液

　　(1×107 CFU/mL)中的可吸收明胶海绵植入缺损部位以诱导感染，逐层缝合切口。术后不进行抗生素治疗。2 周后随机挑取 3 只家兔，观察创面是否有窦道形成并获取桡骨标本，进行 Giemsa 染色和苏木精 - 伊红染色，以进一步验证感染性骨缺损模型的建立。验证造模成功后，腹腔注射 3% 戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉剩余 30 只家兔，暴露感染性骨缺损区后进行简单清创和冲洗，采用随机数字表法分 3 组干预：空白组 (n=10)

　　不做任何处理，对照组 (n=10)骨缺损区注射 0.5mL 透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，实验组(n=10)

　　骨缺损区注射 0.5mL 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶，逐层缝合切口。术后允许家兔自由活动。注射 12 周后，麻醉后处死所有家兔，获取左前臂桡骨标本并保存在 40g/L 多聚甲醛溶液中，以进行后续相关检测。

　　Micro-CT 扫描：获取桡骨标本后，通过 Micro-CT 扫描分析骨再生情况，使用多模态三维可视化软件重建每个样本的三维图像，对缺损部位指定感兴趣区域内的骨体积分数和骨密度进行分析，以定量分析新骨形成。

　　组织形态观察：桡骨样本在 Micro-CT 扫描后进行分级乙醇系列脱水和脱钙处理，然后将样本固定在石蜡中，切成 3.0-4.0μm 厚的切片，分别进行苏木精 - 伊红、Masson 三色与吉姆萨染色，置于显微镜下观察并拍照。

　　RT-qPCR 检测：提取切口处的肉芽组织，使用快速提取法提取组织总 RNA，采用 RT-qPCR 检测肿瘤坏死因子 α、白细胞介素 6 mNRA 表达。检测方法同上。基因引物设计见表 1。

　　免疫组化染色：将脱钙后的骨组织包埋于石蜡中，然后切成 5μm 大小的薄片，将切好的薄片分别与 RUNX2 和骨钙素抗体在 4℃下孵育过夜，与异硫氰酸荧光素缀合的山羊抗兔疫球蛋白 IgG 抗体孵育 1h，置于显微镜下观察图像并拍照，使用 Image J 软件计算 RUNX2 和骨钙素阳性细胞数量。

　　1.5 主要观察指标

　　载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的形貌、力学性能及体外药物释放、生物相容性、抗菌、促成骨分化性能，以及体内修复感染性骨缺损的效果。

　　1.6 统计学分析

　　所有实验数据均从 3 个独立实验中获得，并以 x±s格式表示。使用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，组间比较进行 t 检验或单因素方差分析。

　　P<0.05

　　为组间差异有显著性意义。该文统计学方法已经西安市中心医院生物统计学专家审核。

　　2. 结果

　　2.1 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的构建及表征

　　载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶具有稳定的成胶性能;扫描电子显微镜下可见载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶具有良好的多孔结构，孔径在 100-300μm 之间。对载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶进行流变检测，发现随着温度的升高，水凝胶的储能模量(G’)始终大于耗能模量(G’’)，证实该水凝胶具有良好的力学性能。载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的体外药物释放曲线显示，在最初的 1 周内万古霉素呈现快速释放，释放的药物量为 (37.07±2.61)%，而后药物释放逐渐减缓，在第 42 天释放达到平衡，万古霉素的持续释放量为 (58.54±3.94)%。

　　2.2 载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的生物相容性

　　培养 1、3d 的活死染色结果显示，各组的活细胞数量(绿色荧光)明显多于死细胞数量(红色荧光)，并且 3 组之间活细胞和死细胞数量无明显差别，见图 2A 所示。CCK-8 检测结果显示，随着培养时间的延长，各组细胞吸光度值增加，相同培养时间下 3 组细胞吸光度值比较差异无显著性意义(P>0.05)，见图 2B 所示，表明载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶具有良好的体外生物相容性。

　　3 讨论

　　在骨缺损修复过程中，病原菌引起的感染是影响局部组织和骨再生能力的重要因素 [25]。病原体可通过释放酸性物质和蛋白酶等方式直接损伤细胞外基质成分，降低骨修复能力，但更重要的是可以通过直接抑制成骨细胞和促进破骨细胞形成来抑制骨再生 [26]。根据这一病理机制，此次实验将万古霉素负载到透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶内构建了一种可注射药物递送系统，通过局部缓释万古霉素抑制细菌的增殖并改善软局部成骨微环境，从而促进骨再生。

　　万古霉素是一个高度交联的七肽糖苷配基结构，该结构使其能够与细菌细胞壁肽聚糖前体末端结合来发挥作用，尤其是革兰阳性菌，是治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌感染的首选药物 [37]。此次实验结果表明，载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶能够早期迅速释放万古霉素，并且体外抗菌实验证实，载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶能够同时杀灭大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，并且抑菌效果长达 48h;体内抗菌实验表明，该复合水凝胶植入体内后可以有效杀灭金黄色葡萄球菌，减轻感染状态。

　　对于骨科植入物来说，除了关注抗菌活性，其生物相容性和成骨活性更应得到重视。体外实验结果表明，在加入万古霉素前后透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶的生物相容性不发生明显变化，未对骨髓间充质干细胞的活性造成影响。碱性磷酸酶是一种早期成骨分化标志物，在细胞外基质成熟后表达，参与骨重建过程 [25]。此次实验研究了载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶体外对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，结果证实载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶可以促进早期及晚期的成骨分化。体内实验结果表明，载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖凝胶可以通过促进 RUNX2 及骨钙素的表达、抑制金黄色葡萄球菌的活性，在体内促进感染性骨缺损的骨修复。

　　已有研究表明，透明质酸可以通过和钛纳米管结合来实现药物的可控性，并且通过聚多巴胺修饰后搭载万古霉素能够实现更好的抗菌性能 [27-28]。此次实验采用桡骨中段切除填充浸泡金黄色葡萄球菌菌液明胶海绵的方法来诱导家兔感染性骨缺损模型，相较于股骨钻孔并且直接注射金黄色葡萄球菌菌液诱导感染的方法，直接切除桡骨并且使用可吸收明胶海绵填充具有造模稳定且简单的优点。家兔桡骨显露容易且具有非承重性，切除后不需要额外固定 [29]。

　　此次实验以透明质酸和氧化葡聚糖作为基础材料构建了具有良好生物相容性和药物缓释性的载体，通过局部微创注射方式将万古霉素递送至感染性骨缺损部位，维持有效药物浓度的同时减轻了药物带来的不良反应。载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶具有良好的孔隙结构，这种多孔隙结构有利于万古霉素在水凝胶网络内自由扩散，并缓释到周围微环境中 [38];使用可吸收明胶海绵可以局限金葡菌菌液防止菌液流失，有效诱导感染。载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶注射可以通过抑制缺损局部细菌的增殖来阻碍感染的发展，从而促进成骨细胞的分化，改善缺损局部的成骨微环境，从而促进骨再生。

　　然而，该研究也存在一定的局限性和不足：并未设置万古霉素的浓度梯度来进行疗效的比对，并且关于体内体外抗菌性的验证不够全面，详细机制还需进一步探究。此外，该水凝胶具有良好的力学性能，保证了在注射过程中不会发生形变 [30]。体外药物释放实验表明，水凝胶中万古霉素在初始的 7d 内存在快速释放情况，这是由于药物释放主要通过材料降解和扩散进行调节，在初始阶段，水凝胶尚未开始降解，药物主要通过自由扩散释放，这也有利于万古霉素在短时间内快速达到有效浓度 [6,31];而后缓慢释放长达 49d，释放量达到将近 60%，满足临床用药时间需求 [21,32]。总的来说，此次实验制备的复合水凝胶展现了较好的孔隙率、力学性能以及药物缓释性能，这对万古霉素在局部持续释放、减少局部不良反应具有重要意义。

　　此次实验以透明质酸和氧化葡聚糖混合凝胶作为载体，通过物理共混的方法将万古霉素装载入复合水凝胶中，从而构建了一种具有抗菌和促成骨双功能的药物缓释体系，该复合水凝胶在体外展现了良好的缓释性能、生物相容性、抗菌性能与促成骨性能，并且该复合水凝胶通过在感染性骨缺损局部释放万古霉素杀灭局部病原菌、改善成骨微环境，从而抑制了感染的发展，有效促进骨再生。因此，作为一种新型的可注射双功能水凝胶制剂，载万古霉素透明质酸 / 氧化葡聚糖水凝胶可在原位缓释并保持万古霉素的疗效，从而调节骨再生，为移植物相关感染的治疗提供了一种新途径。

　　成骨细胞与细菌在植入生物材料表面的竞争黏附对于骨再生至关重要 [33]，如果细菌率先附着，会在植入物表面逐渐形成生物膜，随后合成胞外多糖，进而表现出对抗生素及免疫系统强大的耐受性，使感染难以去除，最终导致感染性骨不连 [34]。此次实验通过万古霉素的原位释放来抑制缺损部位金黄色葡萄球菌的增殖，从而改善缺损局部的成骨微环境。研究表明，细菌侵入后的 4 - 6h 是形成生物膜的关键时期 [34]。

任 波;唐永亮;李 妮;刘邦定,西安市中心医院,202534