3种猪细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

来源：中国畜牧兽医杂志2015年第1期北京时间：

作者：王凤雪, 黄双, 刘莹, 杨勇, 孙娜, 朱洪伟, 张淑琴, 程世鹏, 温永俊

单位：1. 中国农业科学院特产研究所, 特种经济动物分子生物学国家重点实验室, 长春 130112;2. 沈阳农业大学, 沈阳 110866

摘要：为建立猪细胞因子SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中3种重要的猪细胞因子即猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、α-干扰素(interferon α,IFN-α)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因.将3种基因克隆至pMD18-T载体上,得到各自阳性克隆质粒,以3种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验.结果表明,当标准品稀释度为1×101~1×106 拷贝/μL时,3种基因的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均≥0.992.熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好.应用建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92株免疫的30日龄猪外周血单核细胞(PBMC)中IL-12、IFN-α和TNF-α表达量进行检测,结果发现,免疫了PRRSV TJM-F92株的猪PBMC细胞内3种细胞因子表达量均极显著升高(P< 0.01).研究结果为IL-12、IFN-α和TNF-α的定量分析提供了技术平台.

关键词：猪;细胞因子;SYBRGreenⅠ;实时荧光定量RT-PCR

基金资助：国家高技术发展计划项目(国家"863"计划项目)(2011AA10A213);吉林省科技发展计划项目(20121823)