猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建与鉴定

来源：中国畜牧兽医杂志2015年第11期北京时间：

作者：周玉照, 马志亮, 孙亭亭, 杨洁, 张小苗, 柴俊, 张娜娜, 张以芳

单位：云南农业大学动物科学技术学院, 昆明 650201

摘要：本试验旨在构建能表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的重组质粒。用疑似患猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病猪的脾脏、肺脏病料提取RNA,根据PRRSV ORF5基因设计1对引物,进行RT-PCR扩增,将ORF5目的基因克隆到pMD19-T载体中,得到pMD19-ORF5重组菌。根据测序结果和表达载体特点,设计1对带有NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,扩增目的片段(dORF5),将其分别与pProEXHTb载体、pNZ8149载体连接,得到HTb-dORF5/DE3和pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌,分别用IPTG和Nisin诱导,再进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,HTb-dORF5/DE3重组菌在1.5 mmol/L IPTG诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约22 ku处有特异性条带,且具有反应原性;pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌在20 ng/mL Nisin诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约19 ku处有特异性条带,间接免疫荧光试验有特异性绿色荧光。本研究成功构建重组质粒HTb-dORF5和pNZ8149-dORF5并获得表达,这为进一步研制预防PRRS疫苗奠定坚实基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV);ORF5基因')">ORF5基因;表达;大肠杆菌;乳酸乳球菌

基金资助：云南省重点新产品开发(2014BB04);云南省院士专家工作站建设项目(2014IC034)