东方马脑脊髓炎病毒TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

来源：中国畜牧兽医杂志2015年第11期北京时间：

作者：郑小龙, 王群, 张晓文, 孙明君, 朱来华

单位：山东出入境检验检疫局, 青岛 266002

摘要：本试验通过RT-PCR从东方马脑脊髓炎病毒(EEEV)中扩增得到128 bp的特异性保守序列,将其克隆到pMD20-T载体中,并进行体外转录,制备标准品cRNA。以10倍系列稀释的cRNA为模板,进行TaqMan MGB荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线,建立了EEEV TaqMan MGB荧光定量RT-PCR的检测方法。进一步对建立的方法进行了特异性和敏感性试验。结果表明,建立的TaqMan MGB荧光定量RT-PCR最低可检测10拷贝/μL的cRNA;且与阴性对照及马鼻肺炎病毒(EHV-1)、马动脉炎病毒(EAV)、马流感病毒(EIV,H3N8)、西尼罗病毒(WNV)、西方马脑脊髓炎病毒(WEEV)和日本马脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应。所制作的标准曲线在1.0×101~1.0×106拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系,相关系数为0.998,标准曲线方程式为y=40-3.35logx;与常规RT-PCR相比,该方法更加快速,特异性和敏感性更高,灵敏度为常规RT-PCR方法的100倍。试验结果表明,建立了一种快速、高效、特异、敏感的EEEV TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法。

关键词：东方马脑脊髓炎病毒;TaqManMGB;荧光定量RT-PCR

基金资助：国家质检总局科技项目(2014IK240)