CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

来源：中国畜牧兽医杂志2016年第1期北京时间：

作者：李晓敏, 任红艳, 毕延震, 刘西梅, 郑新民, 吴民耀

单位：1. 陕西师范大学生命科学学院, 西安 710119;2. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所, 动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室, 武汉 430064

摘要：本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素(SST)基因定点修饰靶点的活性。试验设计5个长20 bp的单链导向RNA(sgRNA),即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性。结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功。靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据。

关键词：猪;生长抑素基因;Cas9酶;单链导向RNA(sgRNA);体外转录

基金资助：国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08010-003、2014ZX08006-003);湖北省农业科技创新中心课题(2011-620-001-003);湖北省农业科学院青年基金(2014NKYJJ02)