猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

来源：中国畜牧兽医杂志2022年第11期北京时间：

作者：张天爱, 李婷婷, 陶晓莉, 李藤菲, 林家锋, 胡思漫, 刘文秀, 佟伟, 李永刚

单位：锦州医科大学基础医学院, 锦州 121001

摘要：【目的】 探索猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV） S蛋白的结构和功能，为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】 以PEDV经典CV777株为模板，通过PCR扩增获得S、S1基因片段；PCR扩增产物分别克隆pET-30a （+）原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体，构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1；将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白，通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测；将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体，获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验（IFA）检测特异性，通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价；将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞，以制备的多克隆抗体为一抗，经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】 成功克隆出PEDV S和S1基因，构建了可表达PEDV-S重组蛋白的原核表达质粒和在HEK293T细胞中高效表达S1蛋白的真核表达质粒；PEDV-S重组蛋白在IPTG为0.5 mmol/L、16 ℃诱导8 h条件下可获得最高表达量，主要以包涵体形式存在；Western blotting结果显示，PEDV-S重组蛋白成功表达；ELISA检测结果显示，制备的多克隆抗体效价达1：3 280 500；IFA结果显示，多克隆抗体有良好的特异性，可特异性识别PEDV-S和PEDV-S1蛋白。【结论】 本研究获得了PEDV-S重组蛋白，并成功表达S1蛋白，制备出PEDV-S蛋白多克隆抗体，为研究S蛋白的结构和功能提供了条件，为揭示PEDV致病机制奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV);S蛋白;蛋白纯化;原核表达;多克隆抗体

基金资助：辽宁省自然科学基金（2021-MS-334）