非洲猪瘟病毒D250R蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2022年第12期北京时间：

作者：许春梅, 邵明珠, 王心悦, 林佳迪, 郭建雄, 张祥胤, 童德文, 梁瑞英, 赵晓民

单位：1. 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌 712100;2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;3. 河北科技师范学院, 秦皇岛 066604

摘要：【目的】分析非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus，ASFV） D250R蛋白潜在的生物学功能，制备其多克隆抗体，为ASFV D250R蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】应用生物信息学软件分析D250R蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、生物功能及蛋白结构等。通过大肠杆菌表达系统表达重组D250R蛋白，采用镍亲和层析柱和分子筛纯化重组D250R蛋白，Western blotting检测纯化蛋白的反应原性，将纯化的D250R蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，用间接ELISA方法测定多克隆抗体效价，用间接免疫荧光试验（IFA）检测多克隆抗体特异性。【结果】生物信息学分析结果显示，D250R蛋白共由250个氨基酸组成，理论分子质量为29 822.54 u，理论等电点为8.96，为亲水性蛋白，无信号肽及跨膜区。修饰位点预测结果显示，D250R蛋白可能存在15个磷酸化修饰位点，其中丝氨酸（Ser）6个、酪氨酸（Tyr）6个、苏氨酸（Thr）3个；2个N-糖基化修饰位点，分别位于第61和197位氨基酸处。生物学功能预测结果显示，D250R蛋白含有Nudix序列，具有解水解酶活性。蛋白结构预测结果显示，D250R蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲占比分别为49.20%、7.60%、15.20%和28.00%，三维空间结构存在较多α-螺旋，与二级结构预测结果基本一致。将ASFV D250R基因克隆至pET-32a （＋）获得pET-32a-D250R重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在16℃、1 mmol/L IPTG诱导下，D250R蛋白以可溶性和包涵体2种形式表达，蛋白大小约44 ku，蛋白上清经镍亲和层析柱和分子筛层析纯化得到纯度较高的蛋白；Western blotting检测结果显示，重组蛋白具有良好的反应原性；间接ELISA检测结果显示，D250R蛋白抗体效价达到1：256 000，成功制备多克隆抗体；IFA检测结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性。【结论】本研究在分子层面分析了D250R蛋白的理化性质及蛋白结构，在大肠杆菌表达系统中实现了ASFV D250R蛋白的高效表达，纯化的D250R蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有较高的特异性，为深入探讨ASFV D250R蛋白的生物学功能及ASFV相关诊断试剂的研发奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV);D250R蛋白;生物信息学分析;原核表达;多克隆抗体

基金资助：陕西省重点研发计划项目（2018ZDXM-NY-064）；国家自然科学基金（31972645）