蒙古马胎儿成纤维细胞永生化细胞体系建立的研究

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第1期北京时间：

作者：田书岳, 神英超, 王希生, 王敏, 伊敏娜, 才文道力玛, 陶力, 赵毕力格, 芒来, 格日乐其木格

单位：内蒙古农业大学动物科学学院, 内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室, 农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站, 马属动物研究中心, 呼和浩特 010018

摘要：【目的】试验旨在建立永生化蒙古马胎儿成纤维细胞（equine fetal fibroblasts，EFFs）系，为马繁殖与发育生物学研究提供参考。【方法】采用1 mg/mL胶原酶Ⅳ消化分离原代EFFs，利用表达人端粒酶逆转录亚基（hTERT）和潮霉素B抗性的pLV-hTERT-IRES-hygro慢病毒感染EFFs，经潮霉素B筛选得到阳性细胞hTERT-EFFs，以第3代EFFs为对照，采用实时荧光定量PCR检测hTERT mRNA的表达水平，CCK-8法绘制生长曲线检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。使用DNAMAN软件比对分析人、马、小鼠、牛、绵羊、猪多物种TERT核苷酸、蛋白和端粒酶RNA组分（TERC）序列相似性。【结果】原代EFFs在实验室培养体系下可传至17代，但第17代细胞发生了衰老。hTERT基因可成功转入EFFs，并至少稳定表达20代。然而hTERT-EFFs增殖能力显著低于EFFs （P<0.05），hTERT-EFFs凋亡早期细胞率显著高于EFFs （P<0.05）。细胞衰老检测结果表明，hTERT-EFFs β-半乳糖苷酶染色呈阳性。序列相似性比对结果显示，马TERT与hTERT mRNA保守性较高，相似性为73.2%；马TERT与hTERT蛋白保守性较其他物种高，相似性为76.3%，表明马TERT与hTERT在结构和功能上是高度相似；马TERC与人TERC相似性较高，在进化树上位于同一分支，但马TERC与TERT的结合及与端粒酶活性相关的关键核苷酸中存在突变。【结论】单独过表达hTERT可以延长EFFs体外传代次数不超过30代，但仍不足以使蒙古马EFFs细胞高质量永生化，这可能与hTERT与eTERC不相容有关。

关键词：蒙古马;马胎儿成纤维细胞(EFFs);永生化;人端粒酶逆转录亚基(hTERT);细胞增殖

基金资助：国家基金2019年联合基金（31961143025）；内蒙古自治区2021年度科技重大专项（2021ZD0018）；内蒙古重大基金（2019ZD03）；国家自然基金项目（31960657）