布鲁氏菌BPE159基因缺失株的构建及BPE159蛋白对细胞自噬因子表达的影响

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第1期北京时间：

作者：魏春燕, 郭嘉, 朱德馨, 张伟, 朱嘉乐, 邓兴梅, 贾思锋, 刘良波, 张辉

单位：1. 石河子大学动物科技学院, 新疆生产建设兵团动物疾病防控兵团重点实验室, 石河子 832000;2. 齐鲁动物保健品有限公司, 济南 250100

摘要：【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株，研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力，探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒，电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因，连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体，提取质粒进行电转化，构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞，收集细胞总RNA，实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株，观察细菌生长变化趋势；评价S2308ΔBPE159株在不同时间点的生存繁殖能力。【结果】成功构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159和回补株S2308ΔBPE159-C，并可稳定遗传10代。实时荧光定量PCR结果显示，经布鲁氏菌侵染24 h后，与PBS组相比，S2308组中自噬因子ATG5基因表达水平显著降低（P<0.05），Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平极显著降低（P<0.01）；与S2308组相比，S2308ΔBPE159组自噬因子Beclin1、LC3a基因表达水平显著升高（P<0.05），ATG5、LC3b基因表达水平极显著升高（P<0.01）。生长曲线结果显示，在相同培养条件下，S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株与S2308株具有相似的生长变化趋势。胞内生存试验结果显示，侵染8 h后，S2308ΔBPE159株在细胞中的数量极显著低于亲本株S2308（P<0.01），12和24 h存活能力显著低于S2308株（P<0.05）。【结论】本研究成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌BPE159基因缺失株和回补株，S2308ΔBPE159株与S2308株生长趋势相似，但生存繁殖能力明显下降；BPE159基因缺失后布鲁氏菌可促进细胞自噬因子的表达，本研究结果为研究布鲁氏菌分泌蛋白的生物学功能和调控机制奠定了基础。

关键词：布鲁氏菌;BPE159基因')">BPE159基因;基因缺失;自噬

基金资助：重点领域科技攻关计划（2021AB012）；中国博士后基金项目（2021MD703890）