羊口疮病毒129蛋白互作宿主蛋白的筛选与C1QBP基因的克隆分析

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第1期北京时间：

作者：但一昕, 向华, 张焕容, 杨璐, 任玉鹏, 徐颂为, 何翃闳, 朱江江

单位：1. 西南民族大学畜牧兽医学院, 成都 610041;2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室, 成都 610041

摘要：【目的】以羊口疮病毒129（ORFV129）蛋白为研究对象，在构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库的基础上，通过酵母双杂交筛选与其相互作用的蛋白。【方法】采用SmartTM技术构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库。构建诱饵质粒pGBKT7-129，并将其转化至Y2HGold酵母感受态细胞，验证质粒pGBKT7-129是否具有自激活性。对转化了质粒pGBKT7-129的菌液进行生长曲线测定，验证该质粒是否对酵母细胞有毒性作用。以ORFV129为诱饵蛋白，利用酵母双杂交系统筛选出与ORFV129相互作用的宿主胞内蛋白并对阳性菌落进行PCR和测序鉴定。利用DAVID 6.7的GO数据库对胞内宿主蛋白进行功能分类和通路分析，并依据Cytoscape v 3.8.0软件绘制ORFV129与胞内蛋白相互作用的网络图。以山羊脾脏为组织样本，采用RT-PCR技术克隆山羊补体C1q结合蛋白（complement C1q binding protein，C1QBP）基因CDS区序列，并采用在线软件进行生物信息学分析。将C1QBP基因CDS区序列连接至pcDNA3.1（+）构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-C1QBP，并将其转染至山羊鼻甲骨原代细胞进行亚细胞定位分析。【结果】试验成功构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库，文库容量约为6.0×106 CFU/mL。成功构建诱饵质粒pGBKT7-129，重组质粒pGBKT7-129无自激活能力且对酵母细胞无毒性。利用酵母双杂交筛选出14个与ORFV129进行互作的胞内蛋白并对阳性克隆进行PCR、测序验证。试验成功克隆山羊C1QBP基因CDS区，长度为837 bp，编码279个氨基酸。系统进化树显示，山羊和绵羊亲缘关系最近。C1QBP蛋白为不稳定的亲水性蛋白，无信号肽结构和跨膜结构域，主要包括3种磷酸化位点，分别是18个丝氨酸、4个苏氨酸和3个酪氨酸位点。C1QBP蛋白二级结构由α-螺旋（33.81%）、无规则卷曲（46.40%）、延伸链（16.91%）和β-转角（2.88%）组成，三级结构与二级结构一致。间接免疫荧光试验表明，C1QBP蛋白散在分布于细胞质中。【结论】筛选出了与ORFV129蛋白相互作用且在天然免疫应答中发挥作用的宿主胞内蛋白C1QBP，通过间接免疫荧光试验验证C1QBP定位于细胞质中，推测ORFV129与能C1QBP相互作用诱导炎症，为进一步验证ORFV129蛋白介导ORFV抑制机体免疫应答的过程奠定基础。

关键词：山羊鼻甲骨原代细胞(GFTCs);羊口疮病毒129(ORFV129);酵母双杂交;互作蛋白;C1QBP

基金资助：西南民族大学优秀学生培养工程（2022NYXXS025）；国家自然科学基金（32072723）；动物遗传育种四川省重点实验室开放基金；四川省科技计划（2020JDJQ0010）；四川省畜禽育种攻关（2021YFYZ0003）；浙江省科技计划（2022C04017）