用于非洲猪瘟病毒核酸检测的假病毒阳性对照品的制备和标定

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第2期北京时间：

作者：李朋霏, 宋晓明, 周保琨, 曹志, 张洪亮, 马清霞, 单虎

单位：1. 青岛农业大学动物医学院, 青岛 266109;2. 青岛市城阳区农业农村服务中心, 青岛 266109;3. 即墨区畜牧业发展服务中心, 青岛 266200

摘要：【目的】制备安全、稳定的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)实时荧光定量PCR阳性对照品。【方法】人工合成含ASFVP72、CD2v和MGF360-12L基因片段的核苷酸序列,将3段基因串联插入腺病毒载体PacAd5中,将重组腺病毒质粒和腺病毒骨架质粒共转染293A细胞,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况,培养10 d后用PCR方法检测假病毒包装情况,将制备的假病毒颗粒加冻干保护剂制备成阳性对照品,进行均一性和稳定性试验,并对制备好的阳性对照品进行核酸拷贝数的绝对定量。【结果】重组腺病毒质粒和腺病毒骨架质粒共转染293A细胞24 h后出现点状荧光,转染后7 d细胞有形成岛屿状感染区的趋势,转染后10 d细胞出现固缩和脱落等明显细胞病变,收获的假病毒液经PCR检测和测序鉴定,结果显示,能扩增出大小约2 400 bp的阳性条带且测序序列与插入片段一致。均一性试验显示,阳性对照品Ct值的变异系数＜1%,表明均一性良好;加速热稳定性试验显示,制备的阳性对照品分别经4 ℃放置7 d、室温(25 ℃)和37 ℃处理24 h后仍能保持稳定;阳性对照品在DNaseⅠ作用1 h后仍具有良好的稳定性;保存期试验表明制备的阳性对照品在－20 ℃下可稳定保存6个月。经微滴式数字PCR(ddPCR)检测结果显示,制备的阳性对照假病毒液的核酸拷贝数为(2.26±0.09)×104拷贝/μL。【结论】本研究成功制备了含有P72、CD2v和MGF360-12L基因片段的ASFV假病毒阳性对照品,可实现对核酸提取与检测过程的全程监控。

关键词：非洲猪瘟病毒(AFSV);假病毒;阳性对照品

基金资助：山东省重点研发计划(重大科技创新工程)"非洲猪瘟防控关键技术研究与应用"(2020CXGC010801-02)