溶血性曼氏杆菌截短型白细胞毒素的原核表达及多克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第6期北京时间：

作者：宋越, 苏胜杰, 张帆, 白帆, 戴伶俐, 王娜, 王大伟, 杨茜雯, 赵世华, 张月梅

单位：1. 内蒙古自治区农牧业科学院, 呼和浩特 010031;2. 内蒙古自治区动物疫病预防控制中心, 呼和浩特 010010;3. 通辽市动物疫病预防控制中心, 通辽 028000;4. 辽宁省农业经济学校, 锦州 121007

摘要：【目的】构建溶血性曼氏杆菌截短型白细胞毒素（LktA）原核表达系统，表达融合蛋白并进行纯化和鉴定，为溶血性曼氏杆菌检测方法的建立提供物质基础。【方法】设计并合成特异性引物，PCR扩增羊溶血性曼氏杆菌lkta截短基因；用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对PCR产物和pET-28b （+）载体进行双酶切，用T4 DNA连接酶将溶血性曼氏杆菌lkta 截短基因克隆到pET-28b （+）载体；使用IPTG诱导融合蛋白LktA的表达。通过Ni2+亲和层析纯化后采用SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行鉴定。用融合蛋白LktA免疫4月龄健康雌性新西兰大白兔制备多克隆抗体，4次免疫完成后进行抗体效价测定。【结果】测序结果表明，构建的表达载体中溶血性曼氏杆菌lkta基因序列正确；融合蛋白LktA的分子质量约为30 ku，在大肠杆菌中高效表达并以包涵体形式存在，在变性条件下纯化融合蛋白LktA电泳图显示条带单一，确定其纯度>90%；纯化的融合蛋白LktA可与His抗体进行特异性结合。将纯化的融合蛋白LktA免疫新西兰大白兔后成功制备出多克隆抗体，抗体效价达1：256 000以上。【结论】本研究成功构建了羊溶血性曼氏杆菌截短型LktA的原核表达载体并制备其多克隆抗体，为后期溶血性曼氏杆菌检测方法的建立提供试验材料。

关键词：截短型蛋白;原核表达载体;毒力因子;致病机理

基金资助：国家自然科学基金青年基金项目（31902305）；内蒙古农牧业科学院青年创新基金项目（31902305）；内蒙古自治区自然科学基金项目（2022MS03069）；内蒙古农牧业创新基金项目（2018CXJJM05）；内蒙古自治区科技计划项目（2022YFHH0141）