AMPK对过氧化氢诱导细胞衰老的阻遏研究

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第6期北京时间：

作者：陈翠, 龚蕾, 徐晢, 汪小波

单位：1. 曲靖医学高等专科学校机能与形态研究所, 曲靖 655000;2. 大理大学基础医学院, 大理 671000;3. 云南省高校细胞生物学重点实验室, 大理 671000

摘要：【目的】构建稳定表达腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/AMPK-T172D的NIH3T3细胞株，探讨AMPK对过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）诱导的细胞衰老的影响。【方法】采用PCR扩增AMPK基因及其突变形式AMPK-T172D，将其克隆至慢病毒载体pLVX-IRES-Puro中，构建pLVX-IRES-AMPK/AMPK-T172D重组质粒并进行双酶切验证。将构建好的重组质粒包装成慢病毒，感染NIH3T3细胞，并利用嘌呤霉素筛选获得NIH3T3稳转细胞株。采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测稳转细胞株中AMPK的mRNA和蛋白表达情况。利用8.8 mmol/L H2O2处理AMPK/AMPK-T172D过表达NIH3T3细胞株，培养2 d后，采用衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated-β-galactosidase，SA-β-Gal）染色检测细胞衰老情况，利用实时荧光定量PCR检测p53、p21及IL-6基因的表达情况。【结果】双酶切验证结果显示，pLVX-IRES-AMPK/AMPK-T172D表达质粒构建成功。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示，与对照组相比，AMPK/AMPK-T172过表达的NIH3T3细胞中AMPK和AMPK-T172D mRNA和蛋白表达水平均极显著或显著升高（P<0.01；P<0.05），肉毒碱棕榈酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1）和脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS） mRNA表达水平显著或极显著升高（P<0.05；P<0.01），SA-β-Gal细胞阳性率极显著降低（P<0.01）；p53、p21和IL-6基因mRNA表达水平显著或极显著降低（P<0.05；P<0.01）。【结论】试验成功获得AMPK/AMPK-T172D过表达NIH3T3稳转细胞株，激活AMPK能降低H2O2诱导的衰老细胞中SA-β-Gal细胞阳性率和衰老相关因子p53、p21和IL-6的表达。试验结果为研究AMPK在衰老中的作用、可能的分子机制及抗衰老治疗策略提供依据。

关键词：AMPK基因')">AMPK基因;持续激活型;稳转细胞株;NIH3T3细胞;衰老

基金资助：国家自然科学基金地区科学基金项目（81860158）；曲靖医学高等学校校级项目（2022XF003）