双峰驼Cyp-A的原核表达及多克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第7期北京时间：

作者：索南吉, 李沛轩, 刘转霞, 王亭玮, 刘柯江, 谢东旭, 曾巍巍, 王雯慧

单位：甘肃农业大学动物医学院, 兰州 730070

摘要：【目的】制备双峰驼亲环素A （cyclophylin A，Cyp-A）的多克隆抗体，为揭示双峰驼体内的黏膜免疫反应机理提供依据。【方法】从GenBank数据库中双峰驼Cyp-A基因序列（登录号：XM_010969543.1）上选取编码区，截取不含信号肽的膜外序列进行碱基优化后，与pET-28a （+）载体连接构建重组质粒pET-28a-Cyp-A。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用IPTG诱导表达并对表达条件进行优化，优化诱导条件后通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。纯化重组蛋白并免疫家兔，制备兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体，分别使用ELISA和Western blotting检测抗体效价及特异性，并采用HE和SABC免疫组化染色法对Cyp-A多克隆抗体进行定位观察。【结果】重组质粒pET-28a-Cyp-A主要以包涵体形式表达，Cyp-A蛋白约为17 ku，最佳诱导条件为0.7 mmol/L IPTG诱导8 h，杂蛋白最佳洗脱液为5 mmol/L咪唑。经ELISA和Western blotting检测，兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体的效价为1：64 000，能特异性识别重组蛋白Cyp-A。经HE和SABC免疫组化染色观察，Cyp-A多克隆抗体仅能使回肠滤泡相关上皮（FAE）中的M细胞特异性着色。【结论】试验成功制备出效价高、特异性强的兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体，能特异性识别双峰驼回肠中M细胞。

关键词：双峰驼;亲环素A(Cyp-A);原核表达;多克隆抗体;定位

基金资助：国家自然科学基金（31960693、31760723）