犬造血干细胞分离、鉴定和培养特性研究

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第7期北京时间：

作者：严涵, 田仰清, 昂艳芬, 汪娅媛, 张学峰, 严玉霖

单位：云南农业大学动物医学院, 昆明 650201

摘要：【目的】研究骨髓来源的犬造血干细胞（cannie hematopoietic stem cells，cHSCs）的分离、鉴定和培养特性，建立体外培养最优条件，为临床应用奠定理论基础。【方法】取3月龄犬骨髓，采用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞（mononuclear cells，MNCs），通过流式细胞仪分选cHSCs并进行体外悬浮培养。用CCK-8法检测cHSCs在不同培养基、不同浓度胎牛血清（FBS）、不同细胞因子、不同cHSCs与cBMSCs接种比例条件下的细胞活性，筛选最优体外培养方案。使用台盼蓝染色计数法统计体外共培养1、7、14、21 d后cHSCs增殖情况。利用流式细胞术和实时荧光定量PCR分别检测P0、P1、P2和P3代cHSCs表面标志物CD34分子阳性百分比以及干性基因性别决定相关基因簇2（SOX2）和八聚体结合蛋白-4（OCT-4）的mRNA表达水平。【结果】成功分离获得cHSCs，不同培养基中细胞活性无显著差异（P>0.05）；不同浓度FBS中，5% FBS组cHSCs活性显著低于10%、15%、20% FBS组（P<0.05），10% FBS组cHSCs活性显著低于20% FBS组（P<0.05）；不同细胞因子条件下，TPO＋FLT-3＋SCF＋IL-6组cHSCs活性显著高于TPO组和TPO+FLT-3组（P<0.05）；不同cHSCs与cBMSCs接种比例条件下，1：10组cHSCs活性极显著高于1：5、5：1和10：1组（P<0.01），5：1接种组cHSCs活性极显著高于1：5和10：1组（P<0.01）。通过筛选的最优培养方案进行体外共培养，第7天时cHSCs进入对数生长期且达到高峰，其中cHSCs＋cBMSCs＋细胞因子组细胞数量显著高于cHSCs＋细胞因子组（P<0.05）。随着cHSCs传代培养，细胞分化潜能发生了变化，P1、P2、P3代细胞CD34分子阳性百分比、SOX2基因mRNA表达水平均极显著低于P0代（P<0.01），P1、P2代OCT-4基因mRNA表达水平极显著高于P0代（P<0.01），P1代OCT-4基因mRNA表达水平极显著高于P2代（P<0.01）。【结论】本研究成功从犬骨髓中分离出cHSCs，筛选的cHSCs体外增殖最优培养条件为含10% FBS的IMDM培养基、cHSCs与cBMSCs接种比例为1：10，同时联合添加TPO＋FLT-3＋SCF＋IL-6细胞因子，P1代cHSCs处于对数生长期且CD34阳性百分比较高，可为今后临床应用提供参考。

关键词：犬造血干细胞(cHSCs);分离;纯化;体外培养

基金资助：云南省朱兴全专家工作站（202005AF150041）；云南农业大学兽医公共卫生省创新团队（202105AE160014）