利用CRISPR/Cas9技术构建PPARγ基因敲除的IPEC-J2细胞系

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第7期北京时间：

作者：张家翔, 韩佃刚, 师亚玲, 毛晓月, 赵凯薇, 杜萱, 信吉阁

单位：1. 云南农业大学动物医学院, 昆明 650201;2. 昆明海关技术中心, 昆明 650200

摘要：【目的】利用CRISPR/Cas9技术敲除猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）的过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）基因，进而在细胞水平上研究PPARγ基因与肠道炎症反应相关的生物学机制。【方法】根据猪PPARγ基因序列（GenBank登录号：NM_214379），在第2外显子区域设计2对sgRNA序列，经退火形成DNA双链后连接至真核表达载体gRNA_GFP-T1；将构建成功的PPARγ正向打靶载体、反向打靶载体、Cas9-nickase质粒共转染至IPEC-J2细胞，经G418药物筛选获得单克隆细胞株，提取单克隆细胞株DNA后进行PCR扩增，经凝胶电泳鉴定后送测序；挑选基因敲除效果最佳的细胞株，利用免疫荧光法检测PPARγ蛋白表达情况。【结果】打靶载体测序结果显示，打靶序列正确连接；经转染、筛选后共获得48株单克隆细胞；测序结果显示，6株单克隆细胞出现双峰，分别为KO-15、KO-17、KO-21、KO-25、KO-32和KO-35；选择底峰较高的KO-25进行免疫荧光检测，结果显示PPARγ蛋白表达降低。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术成功获得了PPARγ基因敲除的IPEC-J2细胞，为后续进一步研究PPARγ基因在炎症反应中的功能奠定了基础。

关键词：CRISPR/Cas9;过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ);IPEC-J2细胞;基因敲除

基金资助：国家自然科学基金项目（31960658、31360532）；云南省自然科学基金项目（2013FB041）；兴滇英才支持计划"青年人才"专项（YNWR-QNBJ-2020-154）