鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2和SO7蛋白的原核表达及SIgA抗体间接ELISA检测方法建立

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第8期北京时间：

作者：侯玉凤, 苏晓彤, 张秋婷, 孙明杰, 陈甜甜, 谢全喜, 谷巍, 王红

单位：山东宝来利来生物工程股份有限公司, 山东省动物微生态制剂重点实验室, 泰安 271000

摘要：【目的】建立检测鸡肠道黏膜柔嫩艾美耳球虫SIgA抗体的间接ELISA检测方法以期对鸡柔嫩艾美耳球虫特异性黏膜免疫水平进行评价。【方法】将鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2和SO7基因克隆至pET-28a(+)原核表达载体,构建EtMIC2-SO7重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。采用镍柱亲和层析法对EtMIC2-SO7重组蛋白进行纯化,用Bradford法测定蛋白浓度。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定法,确定ELISA检测抗原、待检黏膜的最佳工作浓度,通过单一变量法确定最佳待检黏膜孵育时间、封闭液种类、酶标二抗、显色液工作条件,参照ELISA抗体检测试剂盒阴阳性判定标准,以S/P≥0.4 为阳性,S/P＜0.4为阴性作为黏膜样品阴阳性判定标准,对ELISA检测方法的重复性、特异性、敏感性进行验证并与鸡柔嫩艾美耳球虫全蛋白包被ELISA板检测结果进行符合率比较。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果显示,获得大小约70 ku的EtMIC2-SO7重组蛋白,与预期结果相符。ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为2 μg/mL,待检黏膜最适稀释度为1∶40,待检黏膜最适孵育时间为2 h,最适封闭液为5%脱脂奶粉,最适酶标二抗稀释度为1∶100 000,最适反应时间为1 h,最适显色时间为15 min;批内、批间重复性试验变异系数均＜10%;与新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒特异性SIgA抗体无交叉反应性;随机选择2份阳性肠道黏膜样品进行敏感性试验,稀释浓度为1∶80时2份样品仍判定为阳性,说明该检测方法敏感性较好;将EtMIC2-SO7重组蛋白和鸡柔嫩艾美耳球虫全蛋白分别包被ELISA板,检测18份肠道黏膜样品,结果表明EtMIC2-SO7重组蛋白包被ELISA板与球虫全蛋白包被ELISA板符合率可达88.9%(16/18)。【结论】本研究采用原核表达系统成功表达并纯化EtMIC2-SO7重组蛋白,并将其作为ELISA包被抗原,成功建立重复性好、特异性强、敏感性高的鸡柔嫩艾美耳球虫SIgA抗体的间接ELISA检测方法,为球虫黏膜免疫疫苗评价提供了初步检测方法。

关键词：鸡柔嫩艾美耳球虫;分泌型免疫球蛋白A(SIgA);ELISA

基金资助：泰安市科技合作专项计划项目(2017YFD0501000)