大口黑鲈弹状病毒G蛋白胞外区原核表达及多克隆抗体制备

来源：中国畜牧兽医杂志2023年第9期北京时间：

作者：刘海翔, 张佩佩, 邓思, 秦英惠, 姚伦广

单位：1. 南阳师范学院生命科学与农业工程学院, 南阳 473061;2. 河南省畜禽保健品工程技术研究中心, 南阳 473061

摘要：【目的】获得能特异性识别大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV双抗夹心法胶体金试纸条的研制提供材料。【方法】根据GenBank上MSRV G蛋白的基因序列(GenBank登录号:OK272491.1)设计扩增其胞外区的特异性引物,以感染MSRV的GS细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增获得目的序列,双酶切后连接至pET-28a(+)表达载体构建重组质粒pET-28a-ΔG,将重组质粒转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞。挑取测序正确的阳性克隆提取重组表达质粒pET-28a-ΔG,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,再次挑取阳性克隆,测序正确后用IPTG诱导表达。目的蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫BALB/c雌性小鼠,4次免疫后眼眶采血获得抗MSRV G蛋白的多克隆抗体,最后通过ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR结果显示,获得大小为1 323 bp的目的条带。SDS-PAGE结果显示,构建的重组表达质粒可高效表达目的蛋白,Ni柱纯化后获得单一目的蛋白,分子质量在48.5 ku左右,与预期相符,且纯度符合免疫原要求。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别不同批次的MSRV G蛋白。IFA结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别天然状态下的G蛋白。【结论】本研究利用MSRV G蛋白的胞外区重组蛋白成功制备出能特异性识别MSRV G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV的免疫检测和疫苗开发奠定了基础。

关键词：大口黑鲈弹状病毒;G蛋白;原核表达;多克隆抗体

基金资助：国家自然科学基金面上项目(31870917);河南省高校科技创新团队项目(20IRTSTHN024);河南省科技攻关项目(222102110079)